一种微生物核酸提取纯化方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种微生物核酸提取纯化方法及装置。该方法首先对微生物进行裂解，并对裂解物进行预处理；而后加入无菌金属球，利用超声震荡结合宏观震荡的方式使其充分溶出；再加入含十六烷基三甲基溴化铵的第一提取液，经充分提取后利用羟丙基甲基纤维素处理，并通过冻融保证作用效果；在此基础上，加入含氯化铯、8

【技术实现步骤摘要】
一种微生物核酸提取纯化方法及装置


[0001]本专利技术涉及海洋生物医药
，具体涉及一种微生物核酸提取纯化方法及装置。

技术介绍

[0002]核酸的提取与纯化是微生物学的基础实验内容。核酸存在于所有动物细胞、植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸的化学组成、核苷酸排列顺序都不同。核酸主要包括RNA(核糖核酸)和DNA(脱氧核糖核酸)，其中DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。
[0003]核酸提取的原则首先保证核酸一级结构的完整性，其次要排除其它分子的污染。提取核酸时要注意简化步骤，缩短提取时间；减少化学因素对核酸的降解；减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温；防止核酸的生物降解。
[0004]核酸提取大致分为3大部分：破碎、提取、纯化；其中破碎方法主要包括：
[0005]物理方式：煮沸法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、匀浆法；
[0006]化学方式：表面活性剂(SDS法)、碱裂解法；
[0007]生物方式：酶法(溶菌酶、蛋白酶K等)。
[0008]常见的提取方法包括：
[0009]浓盐法：利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离。
[0010]有机溶剂提取法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用。
[0011]高度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物。
[0012]吸附材料结合法：
①
硅质材料高盐低PH值结合核酸，低盐高PH值洗脱
②
阴离子交换树脂低盐高PH值结合核酸，高盐低PH值洗脱
③
磁珠磁珠微粒包裹上不同基因可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。
[0013]胍盐提取结合二氧化硅吸附法：二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解，因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞包括细菌或者病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中的DNA和RNA。
[0014]现有技术中，以上常用的提取方法操作较为繁琐，自动化水平较低，而且整体流程较长，提取效率不高。在这种情况下，如何开发更加简便高效的提取方法和提取装置，一种以来都是本领域中有待解决的技术问题。

技术实现思路

[0015]本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种微生物核酸提取纯化方法及装置，以解决常规提取方法操作较为繁琐，自动化水平较低的技术问题。
[0016]本专利技术要解决的另一技术问题是，常规提取方法流程较长，提取效率不高。
[0017]为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0018]一种微生物核酸提取纯化方法，包括：
[0019]1)将微生物悬液和细胞裂解液混合，在38℃条件下恒温搅拌20～30min；
[0020]2)向其中加入无菌金属球，超声震荡处理20～30min，而后摇匀、弃去金属球、离心取固相，重悬于无菌水中；
[0021]3)向其中加入含有以下成分的第一提取液：十六烷基三甲基溴化铵2％～7％、的盐酸胍0.2～2M、Tris盐酸20～40mM、60～70mM的pH为7.5的EDTA
‑
2Na、0.5～2.2M的NaCl、0.2～0.3％的Triton X
‑
100；在30℃下持续搅拌40～60min；
[0022]4)离心取固相，重悬于无菌水中，向其中加入羟丙基甲基纤维素，反复冻融4～6次，每次保持冷冻时长不短于1min，离心取固相，重悬于无菌水中；
[0023]5)向其中加入含有以下成分的第二提取液：氯化铯1.3～1.5mol/L，8
‑
羟基喹啉15～18mmol/L，聚乙二醇1～1.7g/L；在22℃下持续搅拌80～100min；
[0024]6)离心取固相，重悬于无菌水中，采用乙醇、蛋白酶K、氯仿和正丁醇纯化，而后离心取固相，利用75％乙醇洗涤沉淀物，再利用9.5mM NaOH溶液溶解沉淀。
[0025]作为优选，步骤1)中所述细胞裂解液包括：异硫氰酸胍、α
‑
烯基磺酸钠、酒石酸钾钠。
[0026]作为优选，步骤1)中微生物悬液与细胞裂解液的体积比不大于1:2。
[0027]作为优选，步骤2)中所述摇匀是在摇床上进行的，摇床转速为210～230r/min。
[0028]作为优选，步骤4)中羟丙基甲基纤维素加入后的终浓度为0.1～0.2g/mL；在所述冻融过程中，升温速度和降温速度均不小于3℃/min。
[0029]在以上技术方案的基础上，本专利技术进一步提供了一种微生物核酸提取纯化装置，其特征在于，包括机体，旋转台，环形齿轮，加样管，补液装置，加注装置，突出杆，插口，底架，带插槽支架，连接柱，插槽；旋转台转动安装在机体上，在旋转台外侧套装固定有环形齿轮，在机体中安装有脉冲电动机，所述脉冲电动机与环形齿轮相连接，在旋转台的旋转中心位置固定有突出杆，在底架上设置有插口，插口与突出杆相互嵌合，在底架上具有多个连接柱，带插槽支架固定在连接柱上，在带插槽支架上沿周向均布多个插槽，加样管位于插槽内，在机体上、位于旋转台侧方的位置分别安装有加注装置和补液装置。
[0030]作为优选，加注装置包括储液箱和旋转臂，在储液箱上连接有加注口和排出口。
[0031]作为优选，在底架上沿周向均布有多个槽型的底托，所述底托位于插槽下方。
[0032]作为优选，在机体上设置有上盖，所述上盖与机体固定连接。
[0033]作为优选，在旋转台中内置有电热机构和温控器。
[0034]本专利技术公开了一种微生物核酸提取纯化方法及装置。该方法首先对微生物进行裂解，并对裂解物进行预处理；而后加入无菌金属球，利用超声震荡结合宏观震荡的方式使其充分溶出；再加入含十六烷基三甲基溴化铵的第一提取液，经充分提取后利用羟丙基甲基纤维素处理，并通过冻融保证作用效果；在此基础上，加入含氯化铯、8
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羟基喹啉的第二提取液提取，最后经纯化、沉淀、复溶得到纯品。在此基础上，本专利技术提供了用于执行该提取纯化方法的装置，此装置采用带插槽支架作为承载物，整体搭载于旋转台上，利用脉冲电动机驱动旋转台间歇性转动，依次经过加注装置下方，可实现批量化全程自动加样；同时还配备了补液装置，可根据加注进程定期补液。
附图说明
[0035]图1是本专利技术的装配图；
[0036]图2是不安装底架、带插槽支架时，本专利技术的装配图；
[0037]图3是底架、带插槽支架的构造图；
[0038]图4是旋转台、环形齿轮的构造图；
[0039]其中：
[0040]1、机体2、旋转台3、环形齿轮4、加样管
[0041]5、补液装置6、加注装置7、突出杆8、插口
[0042]9、底架10、带插槽支架11、连接柱12、插槽。
具体实施方式
[0043]以下将对本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物核酸提取纯化方法，其特征在于，包括：1)将微生物悬液和细胞裂解液混合，在38℃条件下恒温搅拌20～30min；2)向其中加入无菌金属球，超声震荡处理20～30min，而后摇匀、弃去金属球、离心取固相，重悬于无菌水中；3)向其中加入含有以下成分的第一提取液：十六烷基三甲基溴化铵2％～7％、的盐酸胍0.2～2M、Tris盐酸20～40mM、60～70mM的pH为7.5的EDTA
‑
2Na、0.5～2.2M的NaCl、0.2～0.3％的Triton X
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100；在30℃下持续搅拌40～60min；4)离心取固相，重悬于无菌水中，向其中加入羟丙基甲基纤维素，反复冻融4～6次，每次保持冷冻时长不短于1min，离心取固相，重悬于无菌水中；5)向其中加入含有以下成分的第二提取液：氯化铯1.3～1.5mol/L，8
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羟基喹啉15～18mmol/L，聚乙二醇1～1.7g/L；在22℃下持续搅拌80～100min；6)离心取固相，重悬于无菌水中，采用乙醇、蛋白酶K、氯仿和正丁醇纯化，而后离心取固相，利用75％乙醇洗涤沉淀物，再利用9.5mM NaOH溶液溶解沉淀。2.根据权利要求1所述的一种微生物核酸提取纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述细胞裂解液包括：异硫氰酸胍、α
‑
烯基磺酸钠、酒石酸钾钠。3.根据权利要求1所述的一种微生物核酸提取纯化方法，其特征在于，步骤1)中微生物悬液与细胞裂解液的体积比不大于1:2。4.根据权利要求1所述的一种微生物核酸提取纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述摇匀是在摇床上进行的，摇床转速为21...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥胜，董克兰，于梦瑶，徐心美，
申请(专利权)人：英特莱检验检测认证山东有限公司，
类型：发明
国别省市：