一种基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体公开了一种基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法，通过磁珠探针和金纳米探针实现对分析物的识别分离和将分析物信号转变放大为核酸信号，利用大量的核酸激活链激活CRISPR/Cas12的反式切割活性，避免了PCR等核酸扩增方法且实现信号的双重放大。相比于传统Elisa方法，操作更简单，灵敏度更高、特异性更强；MMP8蛋白标准品的检测限为100fg/ml，在0

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是一种基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法。

技术介绍

[0002]牙周病是临床常见和高发的慢性感染性疾病之一，近年来发病率有逐年上升的趋势。全球牙周炎患病率从5％至60％不等，重型牙周炎影响了全球约10.8％的人口，是全球第六大疾病。随着社会的发展、生活方式的改变和人均寿命的增加，牙周炎的发病率居高不下，随着年龄的增长，严重牙周炎的患病率也在增加。目前，传统的临床和影像学检查仍是诊断牙周炎，评估其治疗效果和预后的主要手段。且只有在牙周病的生物学发病后，临床检查才能提供诊断。由于牙周炎通常经历一个缓慢而长期的发展过程，牙周组织进行性丧失，且在很大程度上是不可逆的，因此早期诊断和监测对至关重要。然而，目前的临床诊断手段还不能满足牙周炎检测的需要。
[0003]基质金属蛋白酶8(matrix metalloproteinases 8，MMPs 8)是与牙周软组织中的主要胶原基质降解酶，可降解Ⅰ～Ⅲ型胶原，破坏牙周结缔组织。MMP
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8在牙周炎患者唾液中的检测水平反映出牙周病变的严重程度，且在临床上对牙周炎诊断显示出相当有效的效果。可通过监测唾液MMP
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8的变化，判断牙周状态，为评价临床治疗效果、评估牙周炎发展变化及预后提供依据。
[0004]近年来CRISPR/Cas在生物传感领域显示出巨大的应用前景，特别是当发现几种Cas效应子的反式切割活性时，结合多种检测技术的CRISPR/Cas系统被开发出来用于各种靶点检测，拓宽了CRISPR/Cas系统的应用范围，使系统更加成熟，目前大多数报道的集中于基于CRISPR/Cas的生物传感器用于核酸检测，非核酸靶标的应用仍处于早期阶段，包括生物标志物蛋白检测。传统的ELISA方法远远不能满足检测生物标志物蛋白的要求，尤其是超低浓度的早期临床疾病诊断。为此，开发了基于CRISPR/Cas系统的生物传感器平台以提高蛋白质的灵敏度和检测范围。CRISPR/Cas系统结合各类生物转导元件，包括核酸适配体、DNA核酶、酶反应、抗原抗体相互作用、变构探针、体外转录过程、空间位阻效应子等定量分析各种蛋白质检测限可以达fM级别，无需核酸扩增技术，显著提高检测的灵敏度。
[0005]因此，亟待提出一种基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的牙周炎唾液生物标志物MMP8的检测方法。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种灵敏度高、特异性强的基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法。
[0007]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0008]一种基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法，包括以下步骤：
[0009]S1、首先将待测样品加入到捕获抗体修饰的磁珠探针的反应液中，当待测物中含
有目标分析物时，会与磁珠探针上的捕获抗体结合，通过磁分离去除非靶标分子；
[0010]S2、接着加入检测抗体和激活链修饰的金纳米探针，探针上的检测抗体会与靶标分子上的其他抗原位点结合，形成磁珠探针
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分析物
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金纳米探针的三层夹心结构，实现MMP8识别信号到CRISPR反式切割活性信号的转化；通过实时荧光定量分析仪实时观测荧光曲线情况，当样品激活CRISPR/Cas12a酶切反应，出现明显上升的荧光曲线时，待测样品被判定为阳性即含有MMP8；酶切反应未被激活，未出现上升的荧光曲线时，待测样品被判定为阴性即不含MMP8。
[0011]进一步地，所述步骤S1中捕获抗体修饰的磁珠探针的制备方法为：
[0012]取适量磁珠置于EP管中，磁吸2min去上清后用浓度为20mM的MEST缓冲液洗涤磁珠三次，磁吸去上清，加入EDC/NHS活化液25℃活化3h，该EDC/NHS活化液由体积比EDC：NHS＝1：1预混而成；磁吸去上清；用浓度为20mM的MES缓冲液洗涤两次加入MMP 8捕获抗体重新分散磁珠，于25℃偶联3小时；偶联后磁吸去上清，加入含有1％BSA的PBS缓冲液，重新分散磁珠，25℃封闭1小时，以封闭未反应的活化羧基；封闭后，磁吸去上清，用浓度为20mM、pH为7.4的PBS缓冲液洗涤三次，磁吸去上清，用PBS缓冲液重新分散，得到含有捕获抗体修饰的磁珠探针，4℃保存。
[0013]进一步地，所述步骤S1具体包括：取2μL捕获抗体修饰的磁珠探针置于200μLEP管中，加入88μL反应缓冲液，接着加入10μL待测MMP8分析物样品，室温震荡旋混匀1h，磁吸去除上清液，使用反应缓冲液洗涤三次，得到反应液。
[0014]进一步地，所述步骤S2中检测抗体和激活链修饰的金纳米探针的制备方法如下：
[0015]取粒径为30nm的AuNPs置于1.5ml离心管中，加入0.1M Na2CO3溶液调节pH至8.5
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9.0；加入MMP8检测抗体，室温避光轻轻涡旋1h，得到AuNPs
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mAb复合物；三(2
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羧乙基)膦与SH
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ssDNA按照100：1混匀后室温避光还原30min；将还原后的SH
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ssDNA按照1：400加入到AuNPs
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mAb复合物中混匀后，4℃反应过夜；加入30％PEG20000至其终浓度为1％，混匀后室温避光反应1h；分次缓慢加入2M NaCl的磷酸盐缓冲液，以获得0.1M NaCl的最终盐浓度；最后加入浓度为10mM、pH为7.4、含10％BSA磷酸盐缓冲液至其终浓度为1％，室温避光孵育1h；12,000rpm离心20min，弃上清，沉淀用浓度为10mM、pH为7.4磷酸盐缓冲液重悬，重复两次，共洗涤三次去除多余试剂，最终用适量10mM磷酸盐缓冲液重悬，得到检测抗体和激活链修饰的金纳米探针，4℃储存。
[0016]进一步地，所述步骤S2具体包括：
[0017]S21、向反应液中加入98μL反应缓冲液和2μL金纳米粒子探针，孵育1h.磁吸去上清，反应缓冲液洗涤三次，加入25μL浓度为0.1mM的DTT溶液，55℃反应15min,震荡30min，释放SH
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ssDNA，磁吸留上清；
[0018]S22、取2.5μL上清液加入到20μL CRISPR复合物中，加入2.5μLFQ
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reporter，35℃孵育；
[0019]S23、通过实时荧光定量分析仪实时观测荧光曲线情况，当样品激活CRISPR/Cas12a酶切反应，出现明显上升的荧光曲线时，样品被判定为阳性；酶切反应未被激活，未出现上升的荧光曲线时，样品被判定为阴性。
[0020]进一步地，所述步骤S1中的反应缓冲液由10mM PBS+0.05％Tween20+0.1％BSA。
[0021]进一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、首先将待测MMP8分析物样品加入到捕获抗体修饰的磁珠探针的反应液中，当待测物中含有目标分析物时，会与磁珠探针上的捕获抗体结合，通过磁分离去除非靶标分子；S2、接着加入检测抗体和激活链修饰的金纳米探针，探针上的检测抗体会与靶标分子上的其他抗原位点结合，形成磁珠探针
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分析物
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金纳米探针的三层夹心结构，实现MMP8识别信号到CRISPR反式切割活性信号的转化；通过实时荧光定量分析仪实时观测荧光曲线情况，当样品激活CRISPR/Cas12a酶切反应，出现明显上升的荧光曲线时，待测样品被判定为阳性即含有MMP8；酶切反应未被激活，未出现上升的荧光曲线时，待测样品被判定为阴性即不含MMP8。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法，其特征在于，所述步骤S1中捕获抗体修饰的磁珠探针的制备方法为：取适量磁珠置于EP管中，磁吸2min去上清后用浓度为20mM的MEST缓冲液洗涤磁珠三次，磁吸去上清，加入EDC/NHS活化液25℃活化3h，该EDC/NHS活化液由体积比EDC：NHS＝1：1预混而成；磁吸去上清；用浓度为20mM的MES缓冲液洗涤两次加入MMP 8捕获抗体重新分散磁珠，于25℃偶联3小时；偶联后磁吸去上清，加入含有1％BSA的PBS缓冲液，重新分散磁珠，25℃封闭1小时，以封闭未反应的活化羧基；封闭后，磁吸去上清，用浓度为20mM、pH为7.4的PBS缓冲液洗涤三次，磁吸去上清，用PBS缓冲液重新分散，得到捕获抗体修饰的磁珠探针，4℃保存。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：取2μL捕获抗体修饰的磁珠探针置于200μLEP管中，加入88μL反应缓冲液，接着加入10μL待测MMP8分析物样品，室温震荡旋混匀1h，磁吸去除上清液，使用反应缓冲液洗涤三次，得到反应液。4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12和纳米免疫吸附法的MMP8检测方法，其特征在于，所述步骤S2中检测抗体和激活链修饰的金纳米探针的制备方法如下：取粒径为30nm的AuNPs置于1.5ml离心管中，加入0.1M Na2CO3溶液调节pH至8.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，吴志娜，王樱彤，王迪，伊倞佂，包幸福，魏晓曦，宋吉玉，陶施玥，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：