包含靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和T细胞受体的免疫球蛋白单可变结构域的多肽制造技术

本发明专利技术技术旨在提供用于治疗患有癌症的受试者的新型药物。具体地，所述技术提供包含至少四个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，其特征在于一个ISVD结合至TCR且至少两个ISVD结合至GPC3。本发明专利技术技术还提供核酸、载体和组合物。和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖
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3和T细胞受体的免疫球蛋白单可变结构域的多肽
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[0001]本专利技术技术涉及靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖
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3(GPC3)和T细胞受体(TCR)的多肽。本专利技术技术还涉及编码所述多肽的核酸分子和包含所述核酸的载体，以及包含所述多肽、核酸或载体的组合物。所述技术还涉及用于治疗患有涉及异常细胞如癌性细胞或感染细胞的疾病的受试者的方法中的这些产品。此外，所述技术涉及产生这些产品的方法。
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技术介绍

[0002]细胞毒性T细胞(CTL)是杀伤癌细胞、被感染细胞(特别是被病毒感染)或以其他方式受损的细胞的T淋巴细胞。T淋巴细胞(也称为T细胞)在细胞表面上表达T细胞受体(TCR)和CD3受体。αβTCR
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CD3复合物(或“合物(复合物”)由六种不同的I型单一跨膜蛋白构成：形成负责配体识别的TCR异二聚体的TCR体和TCR体链，以及带有胞质序列基序的非共价缔合的CD3及、CD3及、CD3及和ζ链，所述胞质序列基序在受体激活时发生酪氨酸磷酸化并募集大量信号传导组分(Call等人2004,Molecular Immunology 40:1295
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1305)。
[0003]异二聚T细胞受体(TCR)的α链和β链二者都是由恒定结构域和可变结构域组成。T细胞在由自身MHC分子呈递的同源肽的TCR识别时被激活，伴随由酪氨酸磷酸化的CD3复合物启动的信号转导，从而导致T细胞增殖和分化。
[0004]双特异性抗体已经被工程化，其在一个臂(靶标结合臂)上具有肿瘤识别部分，而所述分子的另一个臂具有对T细胞抗原(通常是CD3)的特异性(效应子结合臂)。这些双特异性抗体，即所谓的T细胞接合器(TCE)，是增强患者对恶性细胞的免疫应答的多重靶向分子。通过多特异性抗体进行的T细胞和肿瘤细胞的共接合导致所述T细胞与所述肿瘤细胞之间的溶细胞性突触的形成，所述溶细胞性突触诱导T细胞激活并导致肿瘤细胞杀伤。
[0005]尽管大多数激活T细胞的双特异性抗体靶向T细胞上的CD3复合物，但是一些靶向αβT细胞受体的恒定结构域的双特异性结合物已经描述于WO 2016/180969A1中。
[0006]磷脂酰肌醇蛋白聚糖
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3(GPC3)是GPI锚定的细胞表面糖蛋白，其由硫酸乙酰肝素GAG链和核心蛋白组成。其牵涉于胚胎发生和早期发育中，控制细胞生长和分化。尽管GPC3的表达在发育期间高，但其表达在正常成年组织中几乎不存在，且在肾近端小管和支气管细胞中具有中/低表达。与其在早期发育中的作用一致，在胎盘中也表达高水平的GPC3。
[0007]GPC3经由多种信号传导级联类似地调节早期发育，所述信号传导级联包括Wnt、Hh和YAP途径。另外，GPC3能够与基本生长因子如FGF2相互作用以调节细胞生长。在实验环境中，GPC3的过表达可以抑制FGF2诱导的细胞增殖。相比之下，GPC3还负调节抑制性生长因子BMP7。总之，GPC3的活性可能与背景高度相关，因为其不仅能够抑制细胞增殖，还可以在肝癌和其他形式的癌症中促进致癌作用。
[0008]GPC3表达在来自肝细胞癌(HCC)的肿瘤组织中尤其普遍，所述疾病具有显著未满足的需求。可溶性GPC3在HCC患者的血清中也可以被检测到，并且已经用于区分肝病与不同的病因。
[0009]已经提出了多种形式的双特异性抗体构建体。例如，双特异性抗体形式可能涉及两种抗体或其片段的化学缀合(Brennan,M等人,Science,1985.229(4708):第81
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83页；Glennie,M.J.等人,J Immunol,1987.139(7):第2367
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2375页)。
[0010]然而，这样的双特异性抗体形式的缺点包括高分子量和在高浓度下的高粘度，使得例如皮下施用具有挑战性，并且缺点在于每个结合单元需要两个可变结构域的相互作用以实现特异性和高亲和力结合，这对多肽稳定性和生产效率有影响。这样的双特异性抗体形式也可能潜在地导致与低生产效率和低效价和/或轻链错配或重链错配相关的CMC问题。
[0011]因此，存在对以足够亲和力结合靶细胞和T细胞二者以诱导细胞毒性反应的抗体构建体的需要。同时，这样的构建体不应诱导对非靶细胞的细胞毒性反应，所述非靶细胞即不表达靶抗原或仅以低水平表达靶抗原的细胞。由此，可以在功效与安全性之间达成平衡。另外可期望，这样的构建体可以例如在微生物宿主中有效产生。这样的构建体应理想地还在要治疗的受试者中展现足够长以使得可以方便地间隔开连续治疗的半衰期。此外，可期望限制这样的构建体与要治疗的受试者中预先存在的抗体(即在首次用抗体构建体治疗之前存在于受试者中的抗体)的反应性。此外，所述多肽应不发挥不期望的副作用或仅发挥极小不期望的副作用，例如由对非靶细胞的细胞毒性活性引起的副作用。
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技术实现思路

[0012]本专利技术人发现，同时特异性靶向GPC3和TCR的多肽在体外导致对GPC3表达细胞的有效的T细胞介导的杀伤。所述多肽可以被有效地产生(例如在微生物宿主中)。此外，可以显示这样的多肽展现与要治疗的受试者中的预先存在的抗体(即，在首次用抗体构建体治疗之前存在于受试者中的抗体)的有限反应性。在优选实施方案中，这样的多肽在要治疗的受试者中展现足够长以使得可以方便地间隔开连续治疗的半衰期。此外，这样的多肽仅显示对不表达GPC3或表达低水平GPC3的细胞的有限活性。这表明了诱导针对GPC3阳性癌症靶细胞的高度特异性的T细胞介导的细胞毒性反应，同时展现有利的安全性概况的可能性。
[0013]在一个方面，所述多肽包含至少三个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或由其组成，其中至少两个ISVD特异性结合至GPC3并且一个ISVD特异性结合至T细胞上的TCR的恒定结构域。优选地，特异性结合至GPC3的所述至少两个ISVD特异性结合至人GPC3，并且特异性结合至TCR的所述ISVD特异性结合至人TCR。更优选地，特异性结合至GPC3的所述至少两个ISVD是不同的ISVD。在另一方面，包含至少三个ISVD或由其组成的所述多肽优选地还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元任选地经由一个或多个肽接头来连接，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。例如，所述结合单元可以是结合至血清蛋白、优选地结合至人血清蛋白如人血清白蛋白的ISVD。
[0014]在一个方面，本专利技术技术提供一种包含特异性结合至GPC3的至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或由其组成的多肽。在另一实施方案中，本专利技术技术的多肽包含特异性结合至GPC3的至少两个ISVD或由其组成，其中所述两个ISVD任选地经由肽接头来连接。优选地，特异性结合至GPC3的所述两个ISVD是不同的ISVD。此外，所述多肽优选地还包含一个或多个其他基团、残本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.多肽，其包含至少三个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或由其组成，其中所述ISVD中的每一个包含三个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中所述至少三个ISVD任选地经由一个或多个肽接头来连接，并且其中：a)第一ISVD特异性结合至T细胞上的TCR的恒定结构域并且包含i.作为SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:6的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:10的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:10的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:14的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3；b)第二ISVD特异性结合至GPC3并且包含iv.作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:7的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；v.作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及vi.作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:15的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3；并且c)第三ISVD特异性结合至GPC3并且包含vii.作为SEQ ID NO:8的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:8的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；viii.作为SEQ ID NO:12的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:12的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及ix.作为SEQ ID NO:16的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:16的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，其中所述ISVD的顺序指示从所述多肽的N末端至C末端来看，所述ISVD与彼此的相对位置，其中所述第一ISVD任选地位于所述多肽的N末端处。2.根据权利要求1所述的多肽，其中：a)所述第一ISVD包含作为SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3；b)所述第二ISVD包含作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3；并且c)所述第三ISVD包含作为SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。3.根据权利要求1或2中任一项所述的多肽，其中：a)所述第一ISVD的氨基酸序列展现与SEQ ID NO:2超过90％的序列同一性；b)所述第二ISVD的氨基酸序列展现与SEQ ID NO:3超过90％的序列同一性；并且c)所述第三ISVD的氨基酸序列展现与SEQ ID NO:4超过90％同一性的序列同一性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中：a)所述第一ISVD由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；
b)所述第二ISVD由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成；并且c)所述第三ISVD由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述第一ISVD和所述第二ISVD经由由少于10个氨基酸、优选地少于6个氨基酸组成的接头彼此连接，其中所述接头最优选地是5GS接头。6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元任选地经由一个或多个肽接头来连接，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。7.根据权利要求6所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自由聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、能够结合至血清蛋白的结合单元、Fc部分以及能够结合至血清蛋白的小蛋白或肽组成的组。8.根据权利要求6或7中任一项所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单元选自由能够结合至血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)的结合单元组成的组。9.根据权利要求8所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述结合单元是结合至人血清白蛋白的ISVD。10.根据权利要求9所述的多肽，其中结合至人血清白蛋白的所述ISVD包含i.作为SEQ ID NO:9的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:9的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:13的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:13的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:17的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:17的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3。11.根据权利要求9或10中任一项所述的多肽，其中结合至人血清白蛋白的所述ISVD包含作为SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3。12.根据权利要求9至11中任一项所述的多肽，其中结合至人血清白蛋白的所述ISVD的氨基酸序列展现与SEQ ID NO:5超过90％的序列同一性。13.根据权利要求9至12中任一项所述的多肽，其中结合至人血清白蛋白的所述ISVD由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。14.根据权利要求1至13中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含展现与SEQ ID NO:1超过90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成。15.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。16.多肽，其包含特异性结合GPC3的至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或由其组成，其中所述ISVD包含三个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，并且其中所述至少一个ISVD包含：
a)作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:7的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:15的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，或者b)作为SEQ ID NO:8的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:8的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；作为SEQ ID NO:12的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:12的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及作为SEQ ID NO:16的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:16的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3。17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述至少一个ISVD包含：a)作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或者b)作为SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、作为SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2以及作为SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。18.根据权利要求16或17中任一项所述的多肽，其中所述至少一个ISVD的氨基酸序列包含以下或由以下组成：a)具有与SEQ ID NO:3超过90％的序列同一性的氨基酸序列，或b)具有与SEQ ID NO:4超过90％同一性的序列同一性的氨基酸序列。19.根据权利要求16至18中任一项所述的多肽，其中所述至少一个ISVD包含以下或由以下组成：a)SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或b)SEQ ID NO:4的氨基酸序列。20.多肽，其包含至少两个ISVD或由其组成，其中所述ISVD中的每一个包含三个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中所述至少两个ISVD任选地经由一个或多个肽接头来连接，并且其中：a)第一ISVD和第二ISVD特异性结合至GPC3并且包含i.作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:7的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:15的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，b)第一ISVD和第二ISVD特异性结合至GPC3并且包含i.作为SEQ ID NO:8的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:8的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:12的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:12的2个或1个氨基酸差异的
氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:16的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:16的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，c)第一ISVD特异性结合至GPC3并且包含i.作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:7的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:15的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，并且第二ISVD特异性结合至GPC3并且包含iv.作为SEQ ID NO:8的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:8的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；v.作为SEQ ID NO:12的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:12的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及vi.作为SEQ ID NO:16的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:16的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，d)第一ISVD特异性结合至GPC3并且包含i.作为SEQ ID NO:8的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:8的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:12的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:12的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:16的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:16的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，并且第二ISVD特异性结合至GPC3并且包含iv.作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:7的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；v.作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及vi.作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:15的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，e)第一ISVD特异性结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)的恒定结构域并且包含i.作为SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:6的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:10的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:10的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:14的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，并且第二ISVD特异性结合至GPC3并且包含
iv.作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:7的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；v.作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及vi.作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:15的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，f)第一ISVD特异性结合至GPC3并且包含i.作为SEQ ID NO:7的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:7的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:11的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:11的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及iii.作为SEQ ID NO:15的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:15的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，并且第二ISVD特异性结合至T细胞上的TCR的恒定结构域并且包含iv.作为SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:6的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；v.作为SEQ ID NO:10的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:10的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR2；以及vi.作为SEQ ID NO:14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:14的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR3，g)第一ISVD特异性结合至T细胞上的TCR的恒定结构域并且包含i.作为SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:6的2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列的CDR1；ii.作为SEQ ID NO:10的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：