藏红花器官来源的原生质体分离方法及其应用技术

本申请属于植物细胞分离技术领域，特别是藏红花器官来源的原生质体分离方法及其应用，将藏红花叶片和/或花瓣剪成1mm左右的细丝；后将制备的细丝浸没于酶解液中，酶解液包括1～2wt%Celulose R

【技术实现步骤摘要】
藏红花器官来源的原生质体分离方法及其应用


[0001]本申请属于植物细胞分离
，特别是藏红花器官来源的原生质体分离方法及其应用。

技术介绍

[0002]藏红花(Crocus sativus L.)是一种广泛应用的名贵中药，藏红花仅以雌蕊上部的三根柱头入药，较低的年产量远不能满足市场的巨大需求。作为以花入药的植物，增加开花数量是提高藏红花产量最为有效的方法。因此，寻找控制藏红花开花数量的关键基因并解析其机制，进行种质资源创新，对解决藏红花产量低的瓶颈问题具有重要意义。
[0003]藏红花的稳定遗传转化体系耗时久、尚不完善，这给藏红花开花数量关键基因的筛选、功能研究和分子机制的解析造成一定的阻碍。现今，拟南芥、水稻和玉米等模式植物常采用原生质体瞬时表达体系来验证目标基因功能及解析分子机制。因物种的差异，尚未见关于藏红花器官来源的原生质体瞬时转化体系方面的报道。2016年，吕勤晓发表过《藏红花细胞与小球藻细胞融合研究初探》，其中公开了以含1.5％纤维素酶，0.5M甘露糖醇，5mM氯化钙，pH值5.6的水溶液作为藏红花细胞系的酶解液，但该方法采用藏红花愈伤组织制备原生质体，耗时久，难以推广使用，限制了藏红花领域的相关研究。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的上述技术问题，为此，本申请提出了藏红花花瓣、叶片和根来源的原生质体分离方法，基于分离得到的原生质体并建立了瞬时表达体系，可以快速获得目标性状的候选功能基因，加速基因的功能研究及其分子机制解析，为藏红花的种质资源创新提供重要保障。r/>[0005]一方面，本申请提出了藏红花器官来源的原生质体分离方法，包括步骤S1材料准备，将藏红花叶片和/或花瓣剪成1mm左右的细丝；步骤S2酶解反应，步骤S1制备的细丝浸没于酶解液中，酶解液为水溶液，溶质包括1～2wt％Celulose R
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10，0.2～0.5wt％Macerozyme，20mmol/L MES，0.1wt％BSA，0.4～1.0mol/L Mannitol，10mmol/L CaCl2，20mmol/L KCl，所述酶解液的pH为5.5～5.8，酶解条件为压强30KPa下抽真空30min，并于50rpm，28℃的避光条件下裂解植物细胞3～4h；步骤S3反应终止，加入W5溶液终止酶解反应，所述W5溶液为水溶液，溶质包括154mmol/L NaCl，125mmol/L CaCl2，5mmol/L KCl，2mmol/L MES；所述W5溶液的pH为5.5～5.8；步骤S4原生质体纯化，终止反应后的溶液离心，弃上清，加入预冷的W5溶液重悬原生质体，冰浴并使原生质体自然沉降，除去上清，即可得器官来源的原生质体。
[0006]特别的，选取长度为10～15cm藏红花叶片的中下段和/或浅紫色的藏红花花瓣。
[0007]特别的，酶解液溶质为1.5wt％Celulose R
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10，0.5wt％Macerozyme，20mmol/L MES，0.1wt％BSA，0.7mol/L Mannitol，10mmol/L CaCl2，20mmol/L KCl。
[0008]特别的，叶片组织裂解4h，花瓣组织裂解3.5h。
[0009]特别的，所述步骤S3反应终止，加入与酶解液等体积的W5溶液终止酶解反应，用40μm的细胞筛过滤，除去未被酶解的大块杂质；步骤S4原生质体分离，终止反应后的溶液离心，离心条件为4℃、100g、1～2min，弃上清，加入预冷的W5溶液重悬原生质体，冰浴30min，使原生质体自然沉降，除去上清。
[0010]特别的，还包括步骤S5原生质体备用液制备，用MMG溶液重悬步骤S4分离得到的原生质体，细胞浓度控制为1.5～2
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105细胞/mL备用，所述MMG溶液为水溶液，溶质包括0.7mol/L Mannitol，15mmol/L MgCl2，4mmol/L MES；所述MMG溶液的pH为5.5～5.8。
[0011]另一方面，本申请还提出了藏红花器官来源的原生质体的应用，使用如上述权利要求制备的原生质体备用液，每100μL原生质体备用液中加入15～20μg质粒，接着加入110μL 40％的PEG
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4000，轻柔混匀后室温放置10～15min，再加入440μL W5溶液重新悬浮原生质体，终止转化，100g，室温，离心2min，去掉上清，加入1mL WI，上下颠倒混匀，22℃暗培养12～16h，所述WI溶液为水溶液，溶质0.7mol/L Mannitol，20mmol/L KCl，4mmol/L MES；所述WI溶液的pH为5.5～5.8。
[0012]特别的，如果同时转入多种质粒，按照等摩尔比例加入原生质体备用液中。
[0013]特别的，应用包括单细胞测序、目的基因功能研究、代谢产物的生产、细胞壁再生。
[0014]上述技术方案具有如下优点或有益效果：本申请首次公开了藏红花花瓣、叶片来源的原生质体的分离、培养、转化及在瞬时表达分析上的应用，具有取材方便、高效、快速的优点。本申请的实验结果表明，采用本方法每克鲜重的组织可获得高达105个活性优异的细胞，采用所述藏红花原生质体为受体进行转化，绿色荧光蛋白GFP能够成功表达。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0016]图1是根据本申请实施例1和实施例2制备的藏红花叶片、花瓣和根的原生质体图片，图1(A)为叶片组织及提取的原生质体，图1(B)为花瓣组织及提取的原生质体，图1(C)为根组织及提取的原生质体。
[0017]图2为图1中藏红花原生质体的活力检测，图2(A)为叶片原生质体，图2(B)为花瓣原生质体，图2(C)为根原生质体，有绿色荧光的为活力较好的细胞。
[0018]图3是根据本申请实施例1中PEG介导的原生质体瞬时转化后在激光共聚焦显微镜下的图片，图3(A)为GFP瞬时转化叶片来源的原生质体，叶片和花瓣来源的原生质体的方法类似，此处选择叶片来源的原生质体瞬时转化实验展示，图3(B)为GFP瞬时转化根来源的原生质体，Chlo为叶绿体自发荧光，GFP为绿色荧光通道，Merge为两个通道叠加后成像。
[0019]图4是根据本申请实施例1和实施例2的叶片、花瓣和根在含有不同浓度的纤维素酶和甘露醇的酶解液中原生质体的分离效果，图4(A)由左向右分别为实施例1中采用酶解液一至酶解液五分离叶片来源的原生质体；图4(B)由左向右分别为实施例1中采用酶解液一至酶解液五分离花瓣来源的原生质体；图4(C)由左向右分别为实施例2中采用酶解液一至酶解液五分离根来源的原生质体。
[0020]图5为叶片和花瓣在不同发育时期原生质体的分离情况，图5(A)为采用不同发育
时期的叶片分离原生质体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 藏红花器官来源的原生质体分离方法，其特征在于：包括步骤S1材料准备，将藏红花叶片和/或花瓣剪成1mm左右的细丝；步骤S2酶解反应，步骤S1制备的细丝浸没于酶解液中，酶解液为水溶液，溶质包括1～2wt% Celulose R
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10，0.2～0.5wt% Macerozyme，20 mmol/L MES，0.1wt％ BSA，0.4～1.0 mol/L Mannitol，10 mmol/L CaCl2，20 mmol/L KCl，所述酶解液的pH为5.5～5.8，酶解条件为压强30 KPa下抽真空30 min，并于50 rpm，28℃的避光条件下裂解植物细胞3～4 h；步骤S3反应终止，加入W5溶液终止酶解反应，所述W5溶液为水溶液，溶质包括154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES；所述W5溶液的pH为5.5～5.8；步骤S4原生质体纯化，终止反应后的溶液离心，弃上清，加入预冷的W5溶液重悬原生质体，冰浴并使原生质体自然沉降，除去上清，即可得器官来源的原生质体。2. 根据权利要求1所述的藏红花器官来源的原生质体分离方法，其特征在于：选取长度为10～15 cm藏红花叶片的中下段和/或浅紫色的藏红花花瓣。3. 根据权利要求1所述的藏红花器官来源的原生质体分离方法，其特征在于：酶解液溶质为1.5wt% Celulose R
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10，0.5wt% Macerozyme，20 mmol/L MES，0.1wt％ BSA，0.7 mol/L Mannitol，10 mmol/L CaCl2，20 mmol/L KCl。4. 根据权利要求1所述的藏红花器官来源的原生质体分离方法，其特征在于：叶片组织裂解4 h，花瓣组织裂解3.5 h。5. 根据权利要求1所述的藏红花器官来源的原生质体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽琴，席晓圆，宋佳，李静，钱晓东，周桂芬，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：