一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法及应用技术

本发明专利技术属于生物与新医药技术领域，公开了一种用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法及应用，包括：从市面购买得到三七成品纯干粉，将三七干粉过筛，加入适量PBS，放入匀浆机中制成糊状匀浆，过滤；加入蛋白酶抑制剂，并用1mol/L Tris

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法及应用


[0001]本专利技术属于生物与新医药
，尤其涉及一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法及应用。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30～150nm的膜性囊泡，密度为1.13
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1.19g/ml，有典型的“杯盘”形态。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，近乎于平均每个人体细胞产生1000
‑
10000个。通常1ml血液中存在1
×
10
12
个外泌体。外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。已有研究报道，外泌体在心血管疾病中起重要作用。中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞分泌的外泌体，携载miRNA、lncRNA和蛋白质与心血管疾病密切相关。
[0003]植物外泌体是由植物细胞分泌的纳米级小囊泡，内含DNA、小RNA(small RNA，sRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)和蛋白质等物质，介导细胞间的通讯。植物外泌体通过所含物质发挥抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等作用，参与病原体侵袭的防御反应。植物外泌体纳米粒大多可食用，可作为递送特定药物的载体，无毒性及副作用。近年来，植物来源外泌体或囊泡，因其低毒性、高靶向性、大规模生产可行性，及其可能在生命健康维系中的重要性受到广泛关注。
[0004]三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)别名滇三七，主要分布于云南、广西等地，其以根茎入药，化学成分主要有皂苷、氨基酸、黄酮等。三七具有促进血液循环、保护心脑血管等多种功效；三七能够诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)进入外周血，并促进BMSC归巢于受损部位进行修复。三七总皂苷具有保护平滑肌细胞免受高脂损伤、抗炎、抗凋亡、抗氧化、降血脂、抗凝和促血管生成等功能。外泌体在心血管疾病的发生发展中起重要作用，但来源受限，价格昂贵。而植物来源外泌体，毒性低、靶向性好、安全，具备大规模生产潜力。有研究报道，口服植物来源外泌体能够刺激巨噬细胞发挥抗炎作用，然而来源于跨界的外泌体或囊泡，在心血管中的研究，尚未见报道。
[0005]随着我国居民生活方式改变、饮食、烟草滥用、环境以及工作等多种因素的影响，心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular disease，CVD)的发病率逐年增高。虽然目前面对心血管疾病已有多种多样的药物以及干预手段，但其的发病率仍然逐年增加，对我国造成严重的医疗负担，严重危害国民的生命与健康。
[0006]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0007](1)虽然目前面对心血管疾病已有多种多样的药物以及干预手段，但其的发病率仍然逐年增加，对我国造成严重的医疗负担，严重危害国民的生命与健康。
[0008](2)细胞来源外泌体在心血管疾病的发生发展中起重要作用，但来源受限，价格昂贵。
[0009](3)口服植物来源外泌体能够刺激巨噬细胞发挥抗炎作用，然而来源于跨界的外泌体或囊泡，在心血管中的研究，尚未见报道。

技术实现思路

[0010]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法及应用。
[0011]本专利技术是这样实现的，一种用于治疗心血管的三七干粉外泌体提取方法，所述用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法包括：
[0012]步骤一，从市面购买得到三七成品纯干粉，将三七干粉过筛，加入适量PBS，放入匀浆机中制成糊状匀浆，过滤；
[0013]步骤二，加入蛋白酶抑制剂，并用1mol/L Tris
‑
HCl调节pH至7，差速离心法取沉淀；
[0014]步骤三，用20mmol/L Tris
‑
HCl重悬沉淀，并充分涡旋；
[0015]步骤四，保存在
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80℃或更低温度下备用检测。
[0016]进一步，所述将三七干粉过筛溶解，采用差速离心法离心。
[0017]本专利技术的另一目的在于提供一种用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法的应用，所述用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法的应用包括三七干粉外泌体的鉴定和三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的表型影响。
[0018]进一步，所述三七干粉外泌体的鉴定，包括：
[0019](1)外泌体样品透射电镜观察
[0020]将外泌体取出10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，100kv进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果；
[0021](2)外泌体样品粒径分析，取冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置，外泌体样本用1
×
PBS进行稀释，直接用于NTA检测。
[0022]进一步，所述三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的表型影响，包括：
[0023](1)细胞培养，复苏人脐静脉内皮细胞，传代培养待用；
[0024](2)HUVECs细胞铺板后，将三七干粉外泌体转染至HUVECs培养24小时检测转染效率；
[0025](3)细胞活力检测，将添加三七干粉外泌体不同组别的细胞接种至96孔板，以不同时间点培养后每孔加入10μl CCK
‑
8溶液检测细胞的增殖；
[0026](4)细胞凋亡检测，在添加三七干粉外泌体不同组别不同时间点处理后的细胞，加入195μl Annexin V
‑
FITC结合液轻轻重悬细胞；加入5μl Annexin V
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FITC，轻轻混匀；加入10μl碘化丙啶染色液，上机检测；
[0027](5)Transwell迁移实验，在24孔板的Transwell小室上室接种不同组别的细胞，下室接种含有10％FBS的DMEM培养基，培养24小时后，结晶紫染色后在显微镜下拍照。
[0028]进一步，所述细胞培养，用内皮细胞培养基础培养基+5％胎牛血清+1％内皮细胞
培养添加剂+1％青链霉素双抗；待细胞贴壁面积超过80％后，进行传代或接板；细胞培养需置于培养箱内，培养环境设置为温度37℃，浓度5％CO2。
[0029]进一步，所述三七干粉外泌体转染至HUVECs。取1mL三七干粉源外泌体样纳米囊泡，加入2.5μL的外泌体绿色荧光标记染料(PKH67)染色20min，100000g离心1h，20mmol/L Tris...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法，其特征在于，所述用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法包括：步骤一，从市面购买得到三七成品纯干粉，将三七干粉过筛，加入适量PBS，放入匀浆机中制成糊状匀浆，过滤；步骤二，加入蛋白酶抑制剂，并用1mol/L Tris
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HCl调节pH至7，依次500g、1000g、15000g离心20min，取上清后，再100000g离心1h；步骤三，取沉淀，用20mmol/L Tris
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HCl重悬沉淀，并充分涡旋；步骤四，保存在
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80℃或更低温度下备用检测。2.根据权利要求1所述的用于心血管疾病治疗的三七干粉提取方法，其特征在于，所述将三七干粉过筛溶解，采用差速离心法离心。3.一种实施如权利要求1
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2任意一项所述用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用包括三七干粉外泌体的鉴定和三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的表型影响。4.根据权利要求3所述的用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述三七干粉外泌体的鉴定，包括：(1)外泌体样品透射电镜观察将外泌体取出10μL，吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，100kv进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果；(2)外泌体样品粒径分析，取冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置，外泌体样本用1
×
PBS进行稀释，直接用于NTA检测。5.根据权利要求3所述的用于治疗心血管的三七干粉外泌物提取方法的应用，其特征在于，所述三七干粉外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的表型影响，包括：(1)细胞培养，复苏人脐静脉内皮细胞，传代培养待用；(2)HUVECs细胞铺板后，将三七干粉外泌体转染至HUVECs培养24小时检测转染效率；(3)细胞活力检测，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋立虹，邵瑞飞，滕兆伟，姚梦瑜，曹宇，刘劼，赵婕，程雪梅，罗建丽，陈锐，李昆林，杨童硕，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：