一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法技术

本发明专利技术涉及一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，包括如下步骤：步骤一、供试品样品溶液的制备：步骤1、将阿维菌素发酵料离心，去除上清液，得沉淀物；步骤2、向所述沉淀物中加入丙酮，混合均匀后超声处理10min，然后加入乙酸乙酯，混匀后继续超声10min后离心，得上清液，即供试品样品溶液，备用；步骤二、采用HPLC法对供试品样品溶液进行检测，测定阿维菌素发酵料中阿维菌素B1的含量，即阿维菌素B1发酵效价。本发明专利技术抽提工序简单、工作量少，可以依靠设备完成，减少了人工工作量，省时省力，适合于大批量菌种初筛工作中阿维菌素B1效价的检测工作。菌种初筛工作中阿维菌素B1效价的检测工作。

【技术实现步骤摘要】
一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法


[0001]本专利技术涉及阿维菌素检测
，具体涉及一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法。

技术介绍

[0002]阿维菌素B1，是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的次级代谢产物，且主要存在于阿维链霉菌的菌丝体中，因此，在进行阿维菌素B1的检测时，必须将阿维菌素B1从菌丝体中提取出来，进行供试品溶液的制备。
[0003]然而，目前，在阿维菌素供试品溶液的制备过程中，本公司正在使用的方法为：1、从摇瓶中抽取发酵料5g于离心管中，3500r/min离心15min，倒掉上清液；2、向含有沉淀物的离心管中加入2mL丙酮，在震荡混匀器上混匀，静置10min后在震荡混匀器上震1min，静置10min后再在震荡混匀器上震1min；3、向离心管中加入3mL乙酸乙酯，在震荡混匀器上震1min，随后静置10min后在震荡混匀器上震1min，重复两次；4、将震好的离心管3000r/min离心1min，取上清用甲醇稀释后测定其效价。其存在的问题是：加入丙酮和乙酸乙酯后分别需要在震荡混匀器上震3次，且中间每次震荡完都需要静置10min，当进行大批量的菌种初筛工作时，工作量就显得比较庞大，不仅过程繁琐且费时费力，极大的拖慢了检测效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，其抽提工序简单、工作量少，可以依靠设备完成，减少了人工工作量，省时省力，适合于大批量菌种初筛工作中阿维菌素B1效价的检测工作。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0006]技术方案一：
[0007]一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，包括如下步骤：
[0008]步骤一、供试品样品溶液的制备：
[0009]步骤1、将阿维菌素发酵料离心，去除上清液，得沉淀物；
[0010]步骤2、向所述沉淀物中加入丙酮，采用震荡混匀器混合均匀后超声处理10min，然后加入乙酸乙酯，采用震荡混匀器混匀后继续超声10min后离心，得上清液，定容，即供试品母液，备用。
[0011]步骤3、将供试品母液用甲醇稀释后，得供试品溶液；
[0012]步骤二、采用HPLC法对供试品溶液进行检测，计算阿维菌素发酵料中阿维菌素B1的含量，即阿维菌素B1发酵效价。
[0013]进一步的，步骤1中，所述离心的转速为3500r/min，离心时间为15min。
[0014]进一步的，步骤2中，按阿维菌素发酵料、丙酮、乙酸乙酯质量体积比1g∶0.4mL∶0.6mL，向沉淀物中加入丙酮和乙酸乙酯。
[0015]进一步的，步骤2中，所述离心的转速为3000r/min，离心时间1min。
[0016]进一步的，步骤2中，所述HPLC法具体为：
[0017]一、配制标准溶液：
[0018]准确称取0.1g阿维菌素B1标准品，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶中，配置成浓度为1mg/mL的阿维菌素B1母液，再将阿维菌素B1母液分别进行20倍、10倍、5倍、4倍稀释，配置成相应浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL的标准溶液，备用；
[0019]二、HPLC测定：
[0020]采用高效液相色谱仪分别对不同浓度的标准溶液和供试品溶液进行检测；
[0021]测定条件为：
[0022]色谱柱：Agilent ZORBAX C18色谱柱，内径5grn，4.6
×
250rmn；
[0023]流动相：甲醇∶水＝88∶12；
[0024]进样量20μL；
[0025]柱温：28℃；检测波长245nm；
[0026]三、绘制标准曲线，计算供试品溶液中阿维菌素B1的含量，并计算阿维菌素发酵料中阿维菌素B1的含量，即阿维菌素B1的发酵效价；
[0027]根据HPLC外标法，以标准溶液的浓度为横坐标，以阿维菌素B1的出峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，并依据回归方程计算供试品样品溶液中阿维菌素B1的含量，然后计算发酵料中阿维菌素B1的含量。
[0028]与现有技术相比，本专利技术所取得的有益效果如下：
[0029]本专利技术将发酵液沉淀物与有机溶剂在震荡混匀器上混合均匀后进行超声来实现阿维菌素B1的抽提，其大部分的工作均依靠设备来完成，解放了人力，同时还保证了大批量菌种初筛结果的准确性，为工作人员减轻了大量实验的负担。
[0030]本专利技术简化了阿维菌素B1抽提工序的步骤，使供试品样品溶液的制备工作更为的简单快捷，极大的减少了工作量，且省时省力，可用于阿维菌素B1菌种的批量筛选工作中。
附图说明
[0031]图1为阿维菌素B1标准品的HPLC色谱图；
[0032]图2为供试品溶液的HPLC色谱图；
[0033]图3为阿维菌素B1的标准工作曲线图；
[0034]图4为本专利技术实施例1所述方法及对比例1所述方法的检测结果对照图。
具体实施方式
[0035]以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细的叙述。
[0036]实施例1
[0037]一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，包括如下步骤：
[0038]步骤一、供试品样品溶液的制备：
[0039]步骤1、将V1体积(V1＝5mL)的阿维菌素发酵料置于离心管中，于3500r/min的转速下离心15min，去除上清液，得沉淀物；
[0040]步骤2、向含有沉淀物所在离心管中加入2mL丙酮，采用震荡混匀器混合均匀后超
声处理10min，然后加入3mL乙酸乙酯，继续采用震荡混匀器混合均匀，然后继续超声10min后，3000r/min的转速下离心1min，得上清液，定容5mL，即供试品母液(体积V2＝5mL)，备用；
[0041]步骤3、上机前取供试品样品溶液进行N＝40倍稀释(即取供试品母液50μL，加入甲醇，稀释至2mL)，得供试品溶液。
[0042]步骤二、标准曲线的绘制：
[0043]标准溶液配制：用分析天平准确称取0.1g阿维菌素B1标准品(含量≥95％)，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶中，配置成浓度为1mg/mL的阿维菌素B1母液，再将母液分别进行20倍、10倍、5倍、4倍稀释，配置成相应浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL的标准溶液，备用。
[0044]步骤三：HPLC测定：
[0045]用高效液相仪Agilent 1260 Infinity II对配置好的不同浓度的标准溶液和供试品溶液进行检测；其中阿维菌素B1标准溶液的色谱图如图1所示，阿维菌素B1供试品溶液的色谱图如图2所示；
[0046]测定条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、供试品样品溶液的制备：步骤1、将阿维菌素发酵料离心，去除上清液，得沉淀物；步骤2、向所述沉淀物中加入丙酮，混合均匀后超声处理10min，然后加入乙酸乙酯，混匀后继续超声10min后离心，得上清液，定容，即供试品母液，备用。步骤3、将供试品母液用甲醇稀释后，得供试品溶液；步骤二、采用HPLC法对供试品溶液进行检测，计算阿维菌素发酵料中阿维菌素B1的含量，即阿维菌素B1发酵效价。2.根据权利要求1所述的一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，其特征在于，步骤1中，所述离心的转速为3500r/min，离心时间为15min。3.根据权利要求1所述的一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，其特征在于，步骤2中，按阿维菌素发酵料、丙酮、乙酸乙酯质量体积比1g∶0.4mL∶0.6mL，向沉淀物中加入丙酮和乙酸乙酯。4.根据权利要求1所述的一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，其特征在于，步骤2中，所述离心的转速为3000r/min，离心时间1min。5.根据权利要求1所述的一种阿维菌素B1的发酵效价测定方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯慧云，范令涛，王学伟，
申请(专利权)人：河北兴柏农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：