皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用，该皮肤类器官的构建方法包括以下步骤：S1、人源表皮细胞的提取及培养；S2、真皮细胞的培养；S3、内皮祖细胞的培养；S4、将步骤S1

【技术实现步骤摘要】
皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及一种皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]皮肤是人体的第一道防线，严重皮肤创伤会造成体液流失、感染，甚至威胁患者生命。目前皮肤创伤治疗方法存在皮源有限、免疫排异等问题。类器官有望为临床治疗皮肤创伤提供新型细胞来源，促进创面治疗领域的技术研究。由于皮肤结构复杂，包括表皮、真皮和皮肤附属器等结构，其中表皮由外胚层发育而来，属于上皮细胞，增殖活跃；而真皮由中胚层发育而来，主要包括成纤维细胞及其产生的纤维、基质等，在调控表皮及附属器的增殖和分化方面发挥重要作用，细胞类型多样、调控机制复杂导致目前皮肤类器官体系的研究仍比较薄弱。
[0003]研究表明，体外三维培养小鼠表皮干细胞能形成具有表皮类似结构的表皮类器官；体外培养汗腺干细胞能获得汗腺类似结构的汗腺类器官；而体外培养毛囊干细胞获得的也是表皮类似结构。有研究者体外将诱导多功能干细胞诱导形成外胚层细胞后，继续培养在体外获得了具有毛囊和汗腺结构的皮肤类器官。但诱导多功能干细胞具有潜在的多分化能力和致瘤性，以及培养周期长等缺点，利用成体干细胞获得皮肤类器官的方法有待进一步地开发。另有研究将表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞在体外共培养，在血小板提取物的作用下培养获得了皮肤类器官。但是血小板提取物成分复杂，且易携带病原微生物，这种培养体系中获得的皮肤类器官难以用于在体的组织修复与再生。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术的第一方面，提供一种皮肤类器官培养基，包括：基础培养基和添加在其中的生长因子，所述生长因子包括Wnt3a、IGF、VEGF和bFGF。
[0006]优选的是，所述基础培养基包括添加B27的DMEM
‑
F12、BSA、N
‑
Acetyl
‑
L
‑
cysteine、EGF、bFGF、A83
‑
01、FSK、Penicillin
‑
Streptomycin；
[0007]优选的是，所述生长因子的浓度具体为：50
‑
200ng/mL的Wnt3a、10
‑
40ng/mL的IGF、0.25
‑
1ng/mL的VEGF和5
‑
20ng/mL的bFGF。
[0008]本专利技术的第二方面，提供一种皮肤类器官的构建方法，包括以下步骤：
[0009]S1、人源表皮细胞的提取及培养；
[0010]S2、真皮细胞的培养；
[0011]S3、内皮祖细胞的培养；
[0012]S4、将步骤S1
‑
S3获得的表皮细胞、真皮细胞、内皮祖细胞混合均匀，然后采用如上
所述的培养基进行培养，获得皮肤类器官。
[0013]优选的是，按细胞数量比，表皮细胞：真皮细胞：内皮祖细胞＝1
‑
4：0.5
‑
2：0.5
‑
2。
[0014]优选的是，所述步骤S1具体为：
[0015]S1
‑
1、将人源性皮肤组织依次用碘伏、70％乙醇、PBS浸洗后，去除样本中的皮下组织，并剪成条状，表皮朝上放在消化液里，4℃消化过夜；
[0016]S1
‑
2、将真皮与表皮分离，将表皮切块，置于胰蛋白酶中，37℃消化5分钟，吹打5分钟；用70μm的细胞过滤网过滤后，1000rpm离心5分钟，收集表皮细胞；
[0017]S1
‑
3、按1
×
106个/mL单细胞悬液接种于孔板中，37℃，5％CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，每两天更换培养基；待细胞密度为80～90％时进行传代，用0.25％ EDTA的胰酶37℃消化2～5分钟后，终止并收集细胞，将2
×
105个/mL单细胞悬液接种于孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，每两天更换培养基，获得表皮细胞。
[0018]优选的是，所述步骤S2具体为：
[0019]S2
‑
1、将步骤S1
‑
2得到的与表皮分离的真皮组织切块，转移入胰蛋白酶中，37℃消化30分钟，终止消化并用70μm的细胞过滤网过滤，1000rpm离心5分钟，弃上清，收集真皮细胞；
[0020]S2
‑
2、将步骤S2
‑
1收集的真皮细胞用包含90wt％的DMEM和10％wt的FBS的真皮干细胞培养基制成1
×
106个/mL的单细胞悬液，接种于孔板中，37℃，5％ CO2培养箱中24h后，弃未贴壁细胞，PBS洗一次，后每三天更换培养基；
[0021]S2
‑
3、待细胞密度为90～95％时进行消化传代，用0.25％ EDTA的胰酶37℃消化1～2分钟，终止消化并离心收集细胞，铺板后加入培养基重悬细胞制成2
×
105个/mL单细胞悬液，接种于孔板或培养瓶中，于37℃，5％ CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，获得真皮细胞。
[0022]优选的是，所述步骤S3具体为：
[0023]S3
‑
1、取新鲜抗凝脐带血，等体积比例加入RPMI 1640培养基，轻柔混合均匀，加入适量Ficoll，2000rpm离心30分钟，取中间的白膜层，为脐带血单个核细胞；
[0024]S3
‑
2、将脐带血单个核细胞加入含内皮细胞诱导因子VEGF、bFGF、EGF、地塞米松、10％胎牛血清的M199培养基中，放到孔板中培养，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，1
‑
4周后出现内皮祖细胞克隆，挑取单个克隆，进行扩增培养，获得内皮祖细胞。
[0025]本专利技术的第三方面，提供一种皮肤类器官，其通过如上所述的方法构建得到。
[0026]本专利技术的第四方面，提供一种如上所述的皮肤类器官在制备治疗皮肤创伤的药物中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果是：
[0028]本专利技术首先提供了一种皮肤类器官培养基，其能够有效提高类器官的形成效率；本专利技术建立了成分明确的皮肤类器官培养体系，能都在4
‑
5天内高效获得皮肤类器官，并且获得的皮肤类器官能促进大面积皮肤伤口的愈合，加入伤口部位的表皮化和过度增殖表皮的重塑，这将有利于功能性皮肤创伤的修复，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0029]图1为本专利技术中提取的表皮、真皮和内皮细胞的原代培养图；
[0030]图2为不同生长因子组合条件下皮肤类器官的形成效率测试结果；
[0031]图3为皮肤类器官本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种皮肤类器官培养基，其特征在于，包括：基础培养基和添加在其中的生长因子，所述生长因子包括Wnt3a、IGF、VEGF和bFGF。2.根据权利要求1所述的皮肤类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基包括添加B27的DMEM
‑
F12、BSA、N
‑
Acetyl
‑
L
‑
cysteine、EGF、bFGF、A83
‑
01、FSK、Penicillin
‑
Streptomycin。3.根据权利要求2所述的皮肤类器官培养基，其特征在于，所述生长因子的浓度具体为：50
‑
200ng/mL的Wnt3a、10
‑
40ng/mL的IGF、0.25
‑
1ng/mL的VEGF和5
‑
20ng/mL的bFGF。4.一种皮肤类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、人源表皮细胞的提取及培养；S2、真皮细胞的培养；S3、内皮祖细胞的培养；S4、将步骤S1
‑
S3获得的表皮细胞、真皮细胞、内皮祖细胞混合均匀，然后采用如权利要求1
‑
3中任意一项所述的培养基进行培养，获得皮肤类器官。5.根据权利要求4所述的皮肤类器官的构建方法，其特征在于，按细胞数量比，表皮细胞：真皮细胞：内皮祖细胞＝1
‑
4：0.5
‑
2：0.5
‑
2。6.根据权利要求4所述的皮肤类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：S1
‑
1、将人源性皮肤组织依次用碘伏、70％乙醇、PBS浸洗后，去除样本中的皮下组织，并剪成条状，表皮朝上放在消化液里，4℃消化过夜；S1
‑
2、将真皮与表皮分离，将表皮切块，置于胰蛋白酶中，37℃消化5分钟，吹打5分钟；用70μm的细胞过滤网过滤后，1000rpm离心5分钟，收集表皮细胞；S1
‑
3、按1
×
106个/mL单细胞悬液接种于孔板中，37℃，5％CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，每两天更换...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽星，张京钟，余爽，杜方舟，姬星瑞，曾东鳌，刘梦梦，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：