一种香蕉种质资源分子鉴定的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种香蕉种质资源分子鉴定的方法，具体公开了一种用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库，所述数据库包括特征序列，所述特征序列包括GGKRKDRDNRN、GGKGGDRDNVN、GGGGGGKDK、GGGGKKKKK以及如SEQ ID NO:5～23所示特征序列中的至少一种。本发明专利技术首次公开了用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库，该数据库是通过对香蕉样品的一代测序峰图进行分析得到的，其更加可靠、稳定、丰富和准确，实现简单、快速、更精准地判定香蕉的类别。地判定香蕉的类别。

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉种质资源分子鉴定的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种香蕉种质资源分子鉴定的方法。

技术介绍

[0002]香蕉是芭蕉群(Scitamineae)芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)的主要分布在热带亚热带得常绿多年生单子叶大型草本植物，果肉可食用，迄今已有三四千年的栽培历史，是世界上主要水果作物和重要粮食作物之一。大部分栽培种香蕉是由尖苞蕉(Musa acuminata Colla.)和长梗蕉(Musa balbisiana Colla.)两个野生种及其种间杂交演化而成。按照Simmonds等方法进行香蕉栽培种分类，可将尖苞片蕉性状的基因称为A基因，将长梗蕉性状的基因称为B基因。根据性状分类值及染色体倍数，可将香蕉栽培种分为AA、AAA、AB、AAB、ABB、AAAA、AAAB、AABB、ABBB、BB和BBB等基因型。基因型下面往往分亚组，如根据性状差异将AAA基因型香蕉分为卡文迪许、红蕉、大蜜舍等多个亚组，亚组下面再分为多个栽培品种，如
‘
巴西
’
、
‘
威廉斯
’
、
‘
北蕉
’
等。因此，香蕉学名写法一般为“属名Musa+基因型+亚组名+品种名”，如
‘
M.AAA Cavendish cv.Baxi
’
(AAA基因型，卡文迪许亚组，
‘
巴西
’
)、
‘
M.ABB Pisang Awak cv.Guangfen No1.
’
(ABB基因型，粉蕉亚组，
‘
广粉1号
’
)。然而，这种方法观察周期长，并且容易判断错误。
[0003]目前，常见的做法是采用流式细胞仪测定染色体倍数结合对特定的分子标记的PCR和电泳跑胶的方法对香蕉进行基因组分型鉴定(一种香蕉A、B基因组的分型方法，CN201910399127.8)。但是这种方法有以下缺点：1.需要流式细胞仪和特定的多个限制性内切酶，不具备相应的仪器和酶的实验室很难确定香蕉的倍性；2.鉴定结果主要依靠多对引物的PCR产物及其酶切产物的跑胶条带的微弱变化来判断，结果易受到各种因素干扰，结果不稳定；3.该方法得到的信息有限，只能对香蕉种质进行基因分型，无法进一步确定具体的香蕉类别。
[0004]微卫星(simple sequence repeat，SSR)标记也是建立在PCR基础上的分子遗传标记，已被广泛用于多种农作物品种指纹图谱的构建及杂交种子纯度鉴定研究中。有人从199对引物中筛选出5对多态性及稳定性较高的SSR引物，发现用这5对引物扩增可将56份香蕉种质完全区分开(王静毅，陈业渊，黄秉智，于飞，武耀廷.部分香蕉品种SSR指纹图谱的构建.果树学报,2009,26:733
‑
738.)。然而，出于客观和主观原因，该方法在跑胶后的银染条带统计过程中很容易出错，重复性不能保证。

技术实现思路

[0005]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库。
[0006]本专利技术第二方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的数据库的构建方法。
[0007]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种试剂盒。
[0008]本专利技术第四方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的数据库或本专利技术第三方面的试剂盒在鉴定或辅助鉴定香蕉种质资源中的应用。
[0009]本专利技术五方面的目的，在于提供一种鉴定或辅助鉴定香蕉品种的方法。
[0010]本专利技术六方面的目的，在于提供本专利技术第五方面的方法在香蕉种质资源分类中的应用。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术第一个方面，在于提供一种用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库，所述数据库包括特征序列，所述特征序列包括GGKRKDRDNRN、GGKGGDRDNVN、GGGGGGKDK、GGGGKKKKK以及如SEQ ID NO:5～23所示特征序列中的至少一种。
[0013]优选地，所述香蕉包括云南野生蕉、贡蕉、玫瑰蕉、海贡蕉、佳丽蕉、夫人指蕉、广粉1号、红头粉、不死粉、金粉1号、银粉1号、粉大蕉、北蕉、南天黄、南天红、桂蕉6号、大丰1号、齐尾、中蕉11号、农科1号、华农中把、福选1号、漳早A、红香蕉、桂红蕉1号、畦头大蕉、金山大蕉、紫茎蕉、桂鸡蕉1号、牛角大蕉、美食蕉1号、孟加拉菜蕉、金手指和中蕉9号中的至少一种。
[0014]本专利技术第二个方面，在于提供本专利技术第一方面的数据库的构建方法，包括以下步骤：
[0015](1)以已知品种信息香蕉的基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增ITS序列，得到PCR产物；
[0016](2)将所述PCR产物测序后，打开“.ab1”格式文件，查看测序峰图，选择所述PCR产物的核苷酸序列自5
’
末端起的第420bp左右，长度为9～11bp的核苷酸，作为特征序列，并列出特征序列；
[0017]当所述测序峰图中的峰型是单一峰时，即该区域序列为GGGGXXXXXXX，X代表任何一个单一峰或者套峰，直接输出特征序列；
[0018]当所述测序峰图中大多数峰的峰型是套峰时，需要按照以下规则将套峰进行重编码，并输出特征序列：
[0019]单一峰：A，T，C，G；
[0020]双峰：M＝A&C，R＝A&G，W＝A&T，S＝G&C，Y＝C&T，K＝G&T；
[0021]三峰：V＝A&G&C，H＝A&C&T，D＝A&G&T，B＝G&C&T；
[0022]四峰：N＝A&G&C&T；
[0023](3)根据香蕉的已知分类进行列表，同一分类下特征序列相同的分为一组，并标注相应的特征序列，得到用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库。
[0024]优选地，所述扩增ITS序列所用的引物对为ITSL/ITS4。
[0025]优选地，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示。
[0026]优选地，(1)中所述PCR扩增的反应条件为94～96℃预变性5～10min；94～96℃变性20～40s，50～60℃退火20～30s，70～72℃延伸30～40s，共32～35个循环；70～72℃延伸10～15min。
[0027]优选地，(1)中所述香蕉的基因组DNA可通过目前常用DNA提取方法提取得到，包括但不限于CTAB、SDS、酚氯仿提取法以及采用市售试剂盒进行提取。
[0028]本专利技术第三个方面，在于提供一种试剂盒，包括引物对、记载有本专利技术第一方面的数据库中信息的对比卡。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库，所述数据库包括特征序列，所述特征序列包括GGKRKDRDNRN、GGKGGDRDNVN、GGGGGGKDK、GGGGKKKKK以及如SEQ ID NO:5～23所示特征序列中的至少一种。2.根据权利要求1所述的数据库，其特征在于，所述香蕉包括云南野生蕉、贡蕉、玫瑰蕉、海贡蕉、佳丽蕉、夫人指蕉、广粉1号、红头粉、不死粉、金粉1号、银粉1号、粉大蕉、北蕉、南天黄、南天红、桂蕉6号、大丰1号、齐尾、中蕉11号、农科1号、华农中把、福选1号、漳早A、红香蕉、桂红蕉1号、畦头大蕉、金山大蕉、紫茎蕉、桂鸡蕉1号、牛角大蕉、美食蕉1号、孟加拉菜蕉、金手指和中蕉9号中的至少一种。3.权利要求1或2所述用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库的构建方法，包括以下步骤：(1)以已知品种信息香蕉的基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增ITS序列，得到PCR产物；(2)将所述PCR产物测序后，打开“.ab1”格式文件，查看测序峰图，选择所述PCR产物的核苷酸序列自5
’
末端起的第420bp左右，长度为9～11bp的核苷酸，作为特征序列，并列出特征序列；当所述测序峰图中的峰型是单一峰时，即该区域序列为GGGGXXXXXXX，X代表任何一个单一峰或者套峰，直接输出特征序列；当所述测序峰图中大多数峰的峰型是套峰时，需要按照以下规则将套峰进行重编码，并输出特征序列：单一峰：A，T，C，G；双峰：M＝A&C，R＝A&G，W＝A&T，S＝G&C，Y＝C&T，K＝G&T；三峰：V＝A&G&C，H＝A&C&T，D＝A&G&T，B＝G&C&T；四峰：N＝A&G&C&T；(3)根据香蕉的已知分类进行列表，同一分类下特征序列相同的分为一组，并标注相应的特征序列，得到用于香蕉种质资源分子鉴定的数据库。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述扩增ITS序列所用的引物对为ITSL/ITS4；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾鸿运，吴元立，黄秉智，
申请(专利权)人：广东省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：