一种基于检测RANBP3基因甲基化水平检测乳腺癌的引物组、方法、试剂盒及用途技术

为解决目前现有技术不能基于具有高敏感性及特异性的血浆游离甲基化基因对乳腺癌进行检测的技术问题，本发明专利技术实施例提供一种基于检测RANBP3基因甲基化水平检测乳腺癌的引物组、方法、试剂盒及用途，包括：第一引物组：所述第一引物组包括RANBP3基因正向引物和RANBP3基因反向引物；所述RANBP3基因正向引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述RANBP3基因反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述乳腺癌为HR+/HER2

【技术实现步骤摘要】
一种基于检测RANBP3基因甲基化水平检测乳腺癌的引物组、方法、试剂盒及用途


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种基于检测RANBP3基因甲基化水平检测乳腺癌的引物组、方法、试剂盒及用途。

技术介绍

[0002]据2020年全球癌症统计，乳腺癌在癌症发病率中排名第一，是全球第五大癌症致死原因。乳腺癌的早期发现是患者治疗成功和预后的关键，术后的随访工作同样决定复发患者生存率的高低。症状出现晚、肿瘤恶性程度难以评估以及病程不可预测往往是导致癌症高死亡率的原因。
[0003]传统的乳腺癌诊断包括体检、钼靶x线检查、超声显像检查、磁共振和组织活检。我国乳腺癌筛查起步较晚，主要包括“全国百万妇女乳腺普查工程”和“两癌(乳腺癌和宫颈癌)筛查”。而乳腺癌术后随访只能依靠体检、超声及钼靶x线检查等，钼靶x线检查会对人体产生一定的副作用，对于接近或位于胸壁和致密型乳腺的小癌灶易发生漏诊，并且良性与恶性病变同时存在情况下难以检出恶性病灶，成像伪影易产生误导。体检及超声检查均需乳腺产生实质病变才能检出，缺乏针对乳腺癌早期复发更为敏感且特异的检测方法。
[0004]液体活检作为精准医疗最具代表的诊断技术，越来越多用于癌症早期诊断、预后评估、复发评估、治疗监测等。循环细胞游离DNA(circulating cell
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free DNA)主要来源于凋亡细胞，有研究表明，90％以上的游离DNA来源于肿瘤组织，其半衰期为16分钟至2.5小时，可以实时反应肿瘤负荷情况。cfDNA中的循环肿瘤DNA(circulating tumous DNA,ctDNA)主要用于提供肿瘤基因组的综合信息，肿瘤细胞特异出现的基因突变可作为肿瘤的标志物。
[0005]组织活检目前作为临床诊断的金标准，主要是因为肿瘤组织和细胞与个体诊断最贴近。与液态活检相比，组织活检仍然无法克服时间和空间的异质性，小的活检组织标本无法反映肿瘤全貌等局限性。研究表明，液态活检可以跟踪肿瘤的进化动态和异质性，并可以发现非常早期的治疗耐药性，残留疾病和复发；同时液态活检是无创取样，可以在多个时间点连续取样，有助于监测疾病过程。
[0006]液体活检基于原始肿瘤细胞或DNA释放入血，癌症相关的核酸标记物如表观遗传的改变同样可以释放入血，从而被检测到。许多癌症患者肿瘤基因或原癌基因高甲基化使得基因突变或缺失，并且乳腺癌原发肿瘤与血液具有相似的甲基化模式。
[0007]DNA甲基化分析是一个快速发展的领域，但目前对于乳腺癌具有高敏感性及特异性的血浆游离甲基化基因及基于该基因的检测技术并未见报道，因此，用于乳腺癌检测和随访的可重复的表观遗传血液检测尚未成功发展为常规临床测试。

技术实现思路

[0008]为解决目前现有技术不能基于具有高敏感性及特异性的血浆游离甲基化基因对
乳腺癌进行检测的技术问题，专利技术人采用了乳腺癌组织、乳腺癌旁组织以及乳腺癌外周血分别作为样本，研究了三种样本的候选基因位点的基因的甲基化模式。
[0009]研究证实，乳腺癌组织和乳腺癌旁组织的RANBP3基因甲基化水平与乳腺癌的发生有关，乳腺癌组织和乳腺癌旁组织RANBP3基因的甲基化水平用于检测乳腺癌具有良好的敏感性和特异性。
[0010]研究进一步证实，外周血的甲基化模式与乳腺癌组织甲基化模式一致，外周血的RANBP3基因的甲基化水平用于检测HR+/HER2
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型、HR+/HER2+型或HR
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/HER2+型乳腺癌同样具有良好的敏感性和特异性。从而，可以通过检测外周血中候选基因位点的RANBP3基因的甲基化水平实现对乳腺癌的检测，即乳腺癌外周血中RANBP3基因甲基化改变具有高敏感性及特异性。
[0011]基于专利技术人在研究中发现的对于乳腺癌检测具有高敏感性及特异性的血浆游离甲基化基因，即RANBP3基因；专利技术人根据该基因设计了引物组，通过含有该引物组的用于检测所述基因甲基化水平的试剂或试剂盒，可以实现对乳腺癌的高敏感性及特异性检测。
[0012]基于此，本专利技术实施例提供一种基于检测RANBP3基因甲基化水平检测乳腺癌的引物组、方法、试剂盒及用途。
[0013]本专利技术实施例通过下述技术方案实现：
[0014]第一方面，本专利技术实施例提供一种基于检测RANBP3基因甲基化水平检测乳腺癌的引物组，所述引物组包括：
[0015]第一引物组：所述第一引物组包括RANBP3基因正向引物和RANBP3基因反向引物；所述RANBP3基因正向引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述RANBP3基因反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述乳腺癌为HR+/HER2
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型、HR+/HER2+型或HR
‑
/HER2+型。
[0016]第二方面，本专利技术实施例提供一种用于检测DNA样本中候选基因位点甲基化水平的方法，包括：
[0017]甲基化处理：采用甲基化试剂分别对乳腺癌组织的基因组DNA、乳腺癌旁组织的基因组DNA以及外周血的循环游离DNA进行处理；所述乳腺癌为HR+/HER2
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型、HR+/HER2+型或HR
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/HER2+型；
[0018]PCR扩增：以甲基化试剂处理后的乳腺癌组织的基因组DNA为模板，用第一引物组对其进行PCR扩增；以甲基化试剂处理后的乳腺癌旁组织的基因组DNA为模板，用第一引物组对其进行PCR扩增；以甲基化试剂处理后的外周血的循环游离DNA为模板，用第一引物组对其进行PCR扩增；
[0019]切胶回收：对所有的PCR扩增产物分别进行切胶回收，得到各个PCR扩增产物的纯化产物；
[0020]将所有的PCR扩增产物对应的纯化产物分别进行文库定量及上机测序得到用于分析候选位点甲基化水平的测序数据。
[0021]进一步的，所述用于检测DNA样本中候选基因位点甲基化水平的方法，还包括：
[0022]DNA样本提取：
[0023]分别提取乳腺癌组织的基因组DNA、乳腺癌旁组织的基因组DNA以及外周血的循环游离DNA。
[0024]进一步的，所述用于检测DNA样本中候选基因位点甲基化水平的方法，还包括引物
筛选；所述引物筛选包括：
[0025]根据RANBP3基因甲基化位点分别设计引物；
[0026]对设计的所有引物进行体系测试，并根据体系测试结果筛选出所述第一引物组；
[0027]对设计的所有引物进行体系测试，并根据体系测试结果筛选出所述第一引物组包括：
[0028]分别以甲基化试剂处理后的乳腺癌组织的基因组DNA、甲基化试剂处理后的乳腺癌旁组织的基因组DNA以及甲基化试剂处理后的外周血的循环游离DNA为模板，用每个设计的引物对各个模板进行PCR扩增；
[0029]对每个设计引物的扩增产物进行电泳检测，并根据电泳检测的特异性扩增条带筛选出所述第一引物组。
[0030]进一步的，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于检测RANBP3基因甲基化水平检测乳腺癌的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一引物组：所述第一引物组包括RANBP3基因正向引物和RANBP3基因反向引物；所述RANBP3基因正向引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述RANBP3基因反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述乳腺癌为HR+/HER2
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型、HR+/HER2+型或HR
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/HER2+型。2.一种用于检测DNA样本中候选基因位点甲基化水平的方法，其特征在于，包括：甲基化处理：采用甲基化试剂分别对乳腺癌组织的基因组DNA、乳腺癌旁组织的基因组DNA以及外周血的循环游离DNA进行处理；所述乳腺癌为HR+/HER2
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型、HR+/HER2+型或HR
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/HER2+型；PCR扩增：以甲基化试剂处理后的乳腺癌组织的基因组DNA为模板，用权利要求1所述第一引物组对其进行PCR扩增；以甲基化试剂处理后的乳腺癌旁组织的基因组DNA为模板，用权利要求1所述第一引物组对其进行PCR扩增；以甲基化试剂处理后的外周血的循环游离DNA为模板，用权利要求1所述第一引物组对其进行PCR扩增；切胶回收：对所有的PCR扩增产物分别进行切胶回收，得到各个PCR扩增产物的纯化产物；将所有的PCR扩增产物对应的纯化产物分别进行文库定量及上机测序得到用于分析候选位点甲基化水平的测序数据。3.如权利要求2所述用于检测DNA样本中候选基因位点甲基化水平的方法，其特征在于，还包括：DNA样本提取：分别提取乳腺癌组织的基因组DNA、乳腺癌旁组织的基因组DNA以及外周血的循环游离DNA。4.如权利要求2所述用于检测DNA样本中候选基因位点甲基化水平的方法，其特征在于，还包括引物筛选；所述引物筛选包括：根据RANBP3基因甲基化位点分别设计引物；对设计的所有引物进行体系测试，并根据体系测试结果筛选出所述第一引物组；对设计的所有引物进行体系测试，并根据体系测试结果筛选出所述第一引物组包括：分别以甲基化试剂处理后的乳腺癌组织的基因组DNA、甲基化试剂处理后的乳腺癌旁组织的基因组DNA以及甲基化试剂处理后的外周血的循环游离DNA为模板，用每个设计的引物对各个模板进行PCR扩增；对每个设计引物的扩增产物进行电泳检测，并根据电泳检测的特异性扩增条带筛选出所述第一引物组。5.如权利要求2所述用于检测DNA样本中候选基因位点甲基化水平的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系总...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛雨，胡勤，车红英，韦懿，兰浩淼，陈月华，叶强，
申请(专利权)人：自贡市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：