一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法。设计茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端的HP发夹，加入靶标miRNA

【技术实现步骤摘要】
一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法


[0001]本专利技术属于生物化学分析领域，具体涉及一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法。

技术介绍

[0002]在21世纪，癌症已经严重危害到人们的生命健康，癌症被发现时大多处于癌症晚期，治疗难度大且治疗成功率小。癌症早期诊断技术对于癌症的预防、治疗和愈后都至关重要。microRNA(miRNA)在癌细胞中过表达，能够调控肿瘤相关蛋白表达并与癌细胞的增殖迁移有关。miRNA
‑
21在乳腺癌细胞中过表达，miRNA
‑
375在前列腺癌细胞中表达上调。因此，miRNA作为癌症生物标志物用于癌症早期筛查，但是由于miRNA体积小，需要开发灵敏度高的检测方法。现有检测miRNA的核酸生物传感器所采用的信号放大方法种类较多。CHA、熵驱动等信号放大技术能够实现靶标循环，但对序列设计有特定要求且容易产生较高的假阳性背景信号。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术提供一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法。本专利技术中我们提出利用肿瘤细胞内源性APE1酶辅助miRNA靶标循环结合滚环扩增反应构建具有双重信号放大的荧光生物传感器。该方案的双重信号放大策略能够实现对低浓度靶标的灵敏检测，提高生物传感器的灵敏度。滚环扩增得到含有G四联体的DNA链原位增强硫磺素T荧光信号用于快速实现荧光检测。/>[0004]本专利技术具体提供了如下的技术方案：
[0005]1、一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法，步骤为：
[0006]1)设计茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端的HP发夹，在ThermoPol缓冲溶液中退火形成发夹，靶标miRNA
‑
21杂交HP发夹并反应2h得到miRNA
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21/HP双链；
[0007]2)随后加入APE1酶反应，通过APE1酶切割miRNA
‑
21/HP双链中AP位点释放靶标miRNA
‑
21参与下一个循环及HP1参与RCA反应；
[0008]3)设计哑铃型DP环状模板链，在T4缓冲溶液中退火形成哑铃型结构后加入T4 DNA连接酶环化；HP1与哑铃型DP环状模板杂交，在Bst聚合酶驱动下发生滚环扩增反应得到含有G四联体的DNA长链，加入KCl形成G四联体结构，然后硫磺素T嵌插进G四联体中实现荧光信号增强；
[0009]4)特异性检测：加入靶标miRNA
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21和miRNA
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155，真实样本检测：实验组加入10％血清，加入不同浓度的miRNA
‑
21，利用荧光分光光度计检测荧光信号强度(Ex＝440nm)。
[0010]进一步，步骤1)中制备含有AP位点的发夹HP，PCR程序：75℃处理5min；
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5℃/min降至40℃；
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1℃/min降至37℃，然后在
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20℃保存。
[0011]进一步，步骤2)中优化APE1酶浓度和反应时间：HP为1μM，miRNA
‑
21为1μM，1
×
ThermoPol缓冲溶液，反应总体积10μL，APE1酶浓度为0.05U/μL，37℃反应时间为1h，随后65℃处理20min使APE1酶失活。
[0012]进一步，步骤3)中优化Bst聚合酶浓度为0.2U/μL。
[0013]进一步，步骤3)中优化dNTPs浓度为0.5mM。
[0014]进一步，步骤3)中优化滚环扩增反应时间为3h。
[0015]进一步，步骤4)中荧光分光光度计检测荧光信号强度(HITACHI F7000，Ex＝440nm)。
[0016]本专利技术的有益效果在于：在本专利技术中基于滚环扩增反应和内源性酶构建双重信号放大荧光生物传感器实现了对miRNA
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21的高灵敏度检测分析。当靶标miRNA
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21存在时，触发APE1酶切割HP释放HP1，同时释放miRNA
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21实现靶标循环；HP1结合哑铃型模板DP链引发RCA反应，在Bst聚合酶的作用下得到具有多重G四联体重复单元的DNA长链，嵌入硫磺素硫磺素T产生荧光信号。该检测方法所具有的双重信号放大能够提高生物传感器的灵敏度，实现靶标低浓度检测，检测限低至3.33pM。同时，该生物传感器具有良好的特异性能够有效区分多种miRNA的干扰，避免产生假阳性信号。最后，该生物传感器在10％血清中仍具有良好的检测能力能够精准检测不同浓度靶标。因此，我们提出的针对miRNA
‑
21的生物检测方法能够实现靶标在真实环境中的精准检测，有望将其用于疾病临床诊断。
附图说明
[0017]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：
[0018]图1为本专利技术的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法的示意图；
[0019]图2为含有G四联体的G4
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DNA链的最佳激发波长和最佳发射波长图；
[0020]图3为验证实验序列可行性的PAGE图；
[0021]图4为验证荧光可行性验证RCA产物的荧光信号图；
[0022]图5为优化APE1酶浓度及反应时间的PAGE图；
[0023]图6为优化Bst聚合酶浓度的荧光强度拟合图；
[0024]图7为优化dNTPs浓度的荧光强度拟合图；
[0025]图8为优化滚环扩增反应时间的荧光强度拟合图；
[0026]图9为加入不同浓度的miRNA
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21检测生物传感器性能的荧光光谱图；
[0027]图10为加入不同靶标检测生物传感器特异性分析的荧光光谱图；
[0028]图11为在10％血清样本中加入靶标检测生物传感器性能的荧光光谱图；
具体实施方式
[0029]下面结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。
[0030]实验原理如图1所示，(1)APE1酶辅助靶标miRNA
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21循环并酶切HP发夹环释放HP1，为第一重信号放大设计。为充分实现该步信号放大，我们设计HP发夹的茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端，能够实现APE1酶切以后HP1、HP2、miRNA
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21更好分离，并且HP单独存在无靶标时不会被APE1酶切。(2)制备环状模板DP并杂交HP1引发RCA反应，为第二重信号放大设
计。其中的DP哑铃形环状模板经退火和T4 DNA连接酶连接后得到，然后前一步释放的HP1由于其3
’
端为
‑
OH，当与哑铃型DP链杂交时可在聚合酶驱动下以哑铃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤为：1)设计茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端的HP发夹，在ThermoPol缓冲溶液中退火形成发夹，靶标miRNA
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21杂交HP发夹并反应2h得到miRNA
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21/HP双链；2)随后加入APE1酶反应，通过APE1酶切割miRNA
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21/HP双链中AP位点释放靶标miRNA
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21参与下一个循环及HP1参与RCA反应；3)设计哑铃型DP环状模板链，在T4缓冲溶液中退火形成哑铃型结构后加入T4 DNA连接酶环化；HP1与哑铃型DP环状模板杂交，在Bst聚合酶驱动下发生滚环扩增反应得到含有G四联体的DNA长链，加入KCl形成G四联体结构，然后硫磺素T嵌插进G四联体中实现荧光信号增强；4)特异性检测：加入靶标miRNA
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21和miRNA
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155，真实样本检测：实验组加入10％血清，加入不同浓度的miRNA
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21，利用荧光分光光度计检测荧光信号强度(Ex＝440nm)。2.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤1)所述的HP序列为5
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TCGGAACTA GTCAACATCXGTCTGATAAGCTATGACTAGACCTTCCGAATAGCTT
‑3’
；DP序列为5
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P
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CG CGTTCCCAACCCGCCCTACCCAACGCGGTGGATGTTGACTAGTTCCGAATCCAC
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑛洧，杨宏群，王洪，李昕昊，刘子瑞，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：