【技术实现步骤摘要】
一种检测三种致病菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒
[0001]本专利技术属于食品检测领域,尤其涉及一种检测三种致病菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒。
技术介绍
[0002]细菌性食物中毒占我国食物中毒总数的首位,动物性食品是引起细菌性食物中毒的主要原因。目前对食品中致病菌检测的方法以微生物常规培养法为主,需要2~7天,操作繁琐,所用试剂复杂多样,费用很高,不能满足实际商品流通需要。PCR(聚合酶链式反应)技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点,使用PCR技术检测食品中致病菌的研究方兴未艾。大肠埃希氏菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌是污染动物性食品的三种重要的致病菌。
[0003]现有技术在食品中致病菌检测方面存在以下缺陷和问题:
[0004]1.时间消耗长:传统的微生物常规培养法需要2~7天才能获得检测结果,这对于迅速追溯食品安全问题和及时采取措施来说是不够快速的。
[0005]2.操作繁琐:传统的微生物常规培养法需要复杂的样品处理、培养基制备、菌落鉴定等步骤,操作繁琐,需要经验丰富的专业人员进行操作。
[0006]3.费用高昂:传统的微生物常规培养法涉及大量的培养基、试剂和耗材,成本较高,不适应大规模、高效率的检测需求。
[0007]4.无法满足实际商品流通需要:由于传统方法时间长、操作复杂,无法满足实际商品流通的快速检测需求,可能导致产品已经流入市场或被消费者购买后才发现问题。
技术实现思路
[0008]针对现有技 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测三种致病菌的三重实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,该试剂盒具体包括:扩增引物和特异性荧光探针;所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示:根据大肠埃希氏菌O157:H7的紧密黏附素基因eaeA的特异位点设计两条特异引物,并组成第一对引物:上游引物eaeA
‑
s2:CACCAGAGGAATCGGAGTA(SEQ ID NO:1)下游引物eaeA
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a2:CTGAAAGCGAAATGATGAAG(SEQ ID NO:2)根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly的特异位点设计两条特异引物,并组成第二对引物:上游引物hly
‑
s1:TTCGGCAAAGCTGTTACTA(SEQ ID NO:3)下游引物hly
‑
a1:GGCAAATAGATGGACGATG(SEQ ID NO:4)根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物,并组成第三对引物:上游引物ail
‑
s1:TGAAGTACCGTTATGAACTCG(SEQ ID NO:5)下游引物ail
‑
a1:TGACTTAACCTTTCCGTGAG(SEQ ID NO:6)特异性荧光探针:TAMARA
‑5’‑
CAGTCCTCGCTCACTGGGCA
‑3’‑
FAM,其为SEQ ID NO:3序列,其中FAM为荧光报告基因,TAMARA为荧光淬灭基因。2.如权利要求1所述检测三种致病菌的三重实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述每对引物的上游引物、所述下游引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:2。3.如权利要求1所述检测三种致病菌的三重实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括DNA提取液、PCR反应试剂。4.如权利要求3所述检测三种致病菌的三重实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述DNA提取试剂包括:Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇;所述PCR反应试剂包括:TaqDNA酶、10
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buffer缓冲液、dNTPs、MgCl2和cDNA。5.一种基于如权利要求1
‑
4所述同时检测食品中三种致病菌的三重实时荧光PCR试剂盒的动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法,其特征在于,该方法具体包括:S1:将采集回来的样本进行处理,得到样本基因组DNA;S2:将获得样本基因组DNA使用特异性荧光探针进行扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘廷菊,黄家瑞,张谦,孙端方,杨勇,王楠馨,王赛楠,
申请(专利权)人:贵州省产品质量检验检测院,
类型:发明
国别省市:
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