一种柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于本发明专利技术属于植物病害检测技术领域，具体涉及一种柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒及其应用。本发明专利技术要解决的技术问题是为柑橘黄龙病田间可视化快速检测提供一种新选择。本发明专利技术的技术方案是一种柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒，包括RPA特异性引物对和exo探针；RPA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，exo探针为如SEQ ID No.3所示的单链核苷酸。本发明专利技术所提供试剂盒可以满足柑橘黄龙病田间快速检测需求，可为柑橘黄龙病菌早期检测、流行病学调查提供科学依据，具有良好的发展应用前景。具有良好的发展应用前景。具有良好的发展应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于本专利技术属于植物病害检测
，具体涉及一种柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]柑橘，芸香科、柑橘属植物，是世界第一大类水果、第三大贸易水果，是重要的经济栽培作物。柑橘黄龙病是全球柑橘生产上的“癌症”病害，给我国广东、福建、广西等老病区及近年局部大面积爆发的江西等新病区的11省300余县的柑橘产业造成了数以亿计的巨大经济损失，且近年呈现蔓延趋势。黄龙病由韧皮部限制性内生杆菌属细菌引起，严重影响柑橘产量和品质，甚至造成树木整株的枯死。目前尚缺乏针对黄龙病的根治药剂和抗病品种，在防控上仍以喷施化学农药及挖除病树为主。
[0003]目前对于柑橘黄龙病病菌的检测包括：田间诊断、指示作物鉴定、血清学检测、电镜检测、光谱识别技术检测、碘
‑
淀粉显色检测和分子生物学检测，其中分子生物学检测最为常见，这些检测技术依赖于昂贵的仪器设备、试剂耗材及严格的反应条件等，检测周期长且需要在实验室操作。因此，柑橘黄龙病田间可视化快速检测方法可为对于黄龙病的早检测早发现奠定物质基础，可为其科学防控提供保障。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是为柑橘黄龙病田间可视化快速检测提供一种新选择。
[0005]本专利技术的技术方案是一种柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒，包括RPA特异性引物对和exo探针；RPA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，exo探针如SEQ ID No.3所示的单链核酸。
[0006]SEQ ID No.4上游引物(4F)：GTCATCAACCAAATTAAAATCGAAAACCCC
[0007]SEQ ID No.6下游引物(2R)：ATATATTGTTCACATGAGGGAGCATTTAACC
[0008]SEQ ID No.9exo探针(nrdB
‑
P)：
[0009]CTCCATGAAGCTACCCTCCTCGAAATCGCC[FAM
‑
dT][THF][BHQ1
‑
dT]GCACATGAAACAATGC[C3Spacer]；THF为四氢呋喃、FAM为荧光基团、BHQ1为淬灭基团、3
’
端C3
‑
Spacer为防止探针延伸的阻断物，dT表示取代了胸腺嘧啶T。
[0010]进一步的，所述检测试剂盒还包括DTBIA核酸快速提取盒，其中含有硝酸纤维素膜和甘氨酸缓冲液；所述甘氨酸缓冲液组成为0.1M glycine、0.05M NaCl和1mM EDTA，pH 7.4。
[0011]本专利技术还提供了柑橘黄龙病可视化快速检测的方法，包括如下步骤：
[0012]a、待测样品DNA提取：采集待测样品枝条或叶片，用刀片切取露出新鲜组织并印迹于硝酸纤维素膜上，反复多次印迹后将硝酸纤维素膜浸没于甘氨酸缓冲液中，涡旋混匀洗脱DNA，室温孵育洗脱20min，所得液体为待测样品DNA；
[0013]b、RPA恒温扩增：以待测样品DNA为模板，将所述引物对和探针加入到反应体系中，
进行RPA恒温扩增；
[0014]c、蓝光灯照射可视化：使用蓝光照射扩增产物，透过黄色滤光片查看荧光结果；观察其是否产生绿色荧光，若有则为阳性，即判定为感病植株；若无，即判定为健康植株。
[0015]特别的，步骤a中，甘氨酸缓冲液用量为20μL；室温孵育洗脱20min。
[0016]具体的，步骤b中，RPA恒温扩增为12μL反应体系，包括10μM引物各0.5μL和10μM探针0.2μL。
[0017]具体的，步骤b中，RPA恒温扩增温度为32～50℃，反应时间为20～40min。
[0018]优选的，步骤b中，RPA恒温扩增温度为36～44℃。
[0019]特别的，步骤b中，RPA恒温扩增温度为42℃。
[0020]优选的，步骤b中，RPA恒温扩增反应时间为20min。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本专利技术开发了一种基于DTBIA
‑
RPA技术的柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒，该技术具有以下优点：1.操作简单：本专利技术核酸提取一改往常繁琐步骤，仅需取样、切样、点膜、洗脱；2.成本较低：利用RPA扩增不需昂贵的PCR仪和电泳/凝胶成像仪，且适用温度范围较宽，32～50℃，在较短时间约20～40min均完成核酸扩增反应，不需高温处理(仅需简单发热装置，如保温杯、暖宝宝、小型工业恒温装置等)，更利于实现基层单位及田间现场检测；3.本专利技术基于中国柑橘黄龙病菌株A4全基因组五拷贝nrdB保守序列设计的特异性引物及特异性探针，在目前已发表且拼接完整的黄龙病菌基因组——JXGC(中国广西)、Ishi
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1(日本)、PYN(中国云南)、ReuSP1(法国留尼汪岛)、gxpsy(中国广西)、A4(中国广东)、psy62(美国佛罗里达)、CoFLP(美国哥伦比亚)菌株上均有该位点，具有普遍适用性。相比于常规黄龙病分子检测体系，采用本专利技术的引物、探针，基于优化的检测体系，本专利技术在成本和实际操作中都有优势。采用本专利技术的试剂盒进行检测，操作简单，操作人员不需要经过专业培训，普通果农亦可进行操作。本专利技术所提供试剂盒可以满足柑橘黄龙病田间快速检测需求，可为柑橘黄龙病菌早期检测、流行病学调查提供科学依据，具有良好的发展应用前景，有利于推动柑橘产业的健康持续发展。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例1柑橘黄龙病菌RPA引物及探针的设计与筛选，其中，A为PCR检测，1
‑
48为8条引物的16个组合引物对，其中每3个泳道为同一对引物的扩增产物，其样品依次为待测样品、阳性对照、阴性对照；B为实时荧光RPA检测；C为可视化RPA检测。
[0024]图2为本专利技术实施例2检测体系优化中的RPA体积优化，其中，A为50μL体系；B为12μL体系；C为10μL体系。
[0025]图3为本专利技术实施例2检测体系优化中的温度优化。
[0026]图4为本专利技术实施例3RPA检测体系的特异性检测，其中，1.黄龙病；2.黄脉病；3.衰退病；4.溃疡病；5.黄龙病+黄脉病；6.黄龙病+衰退病；7.黄龙病+溃疡病；8.黄龙病+黄脉病+衰退病+溃疡病；9.黄脉病+衰退病+溃疡病；10.水；11.阴性对照。
[0027]图5为本专利技术实施例4可视化RPA灵敏度检测，其中A为常规PCR检测，B为可视化RPA检测，C为qPCR检测，样品为阳性模板10倍梯度稀释，1
‑
8稀释梯度依次为100、10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7，9为阴性对照。
[0028]图6为本专利技术检测方法流程示意图。
具体实施方式
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柑橘黄龙病可视化快速检测试剂盒，其特征在于：包括RPA特异性引物对和exo探针；RPA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示，exo探针为如SEQ ID No.3所示的单链核酸。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括基于DTBIA(组织印迹)的核酸快速提取盒，包括硝酸纤维素膜和甘氨酸缓冲液；所述甘氨酸缓冲液包括0.1M glycine、0.05M NaCl和1mM EDTA，pH 7.4。3.柑橘黄龙病可视化快速检测的方法，其特征在于：包括如下步骤：a、待测样品DNA提取：采集待测样品枝条或叶片，用刀片切取露出新鲜组织并印迹于硝酸纤维素膜上，反复多次印迹后将硝酸纤维素膜浸没于甘氨酸缓冲液中，涡旋混匀洗脱DNA，室温浸没，所得液体为待测样品DNA；b、RPA恒温扩增：以待测样品DNA为模板，将所述引物对和探针加入到反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅仕敏，万虹岑，周常勇，王雪峰，娄兵海，
申请(专利权)人：西南大学柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：