一种新型抗肿瘤天然产物的筛选平台及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种利用源于患者的肿瘤样细胞簇(patient

【技术实现步骤摘要】
一种新型抗肿瘤天然产物的筛选平台及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种新型天然产物抗肿瘤活性的筛选平台。

技术介绍

[0002]目前肿瘤的治疗方式主要包括手术治疗、化疗药物治疗、靶向药物治疗以及免疫治疗。有些恶性肿瘤的治疗还是以化疗方式为主，但长期化疗会引起头晕呕吐、腹泻、免疫抑制等多种严重不良反应，同时也会产生继发耐药的问题，影响治疗效果。近些年研究发现，具有抗肿瘤活性的天然产物有望解决这一难题。
[0003]天然产物是指动物、植物提取物(简称植提)或昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许许多多内源性的化学成分统称作天然产物，其中主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、各种酶类、糖蛋白、树脂、胶体物、生物碱、黄酮、糖苷类、萜类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、内酯、抗生素类等天然存在的化学成分。其药用的优势主要包括取材便捷、毒性低、可提高机体免疫力等。目前已有很多天然产物的筛选方法，主要包括：动物水平筛选、细胞水平筛选、酶水平筛选。多数集中于细胞系层面，但都存在一定局限性。例如筛选周期长，临床疗效一致性差等。目前已有很多天然产物被证实具有抗肿瘤活性，并且可应用于临床治疗肿瘤的辅助用药，可增效减毒，提高人体免疫力。
[0004]基于微肿瘤PTC的筛选模型，是有肿瘤来源的上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞、免疫细胞自组装和增殖的结果，可以在最大程度上模拟肿瘤微环境。可在7天以内培养成功患者来源的微量肿瘤样本，样本类型丰富，包括：手术组织、穿刺活检组织以及恶性积液，并且针对不同的癌症类型也有对应的培养基，可保证培养成功率达到90％以上。微肿瘤PTC体外模型检测周期短，14天以内可以出具检测结果。同时，PTC在临床疗效一致性上可以达到90％以上。本专利技术以PTC技术为基础，利用PTC体外模型作为具有抗肿瘤活性天然产物的筛选平台，可缩短筛选周期，提高准确性，降低筛选成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足，提供了一种利用微肿瘤PTC体外模型进行天然产物抗肿瘤活性的筛选方法，该方法能缩短筛选周期，提高准确性，降低成本。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种新型天然产物抗肿瘤活性的筛选平台，所述新型筛选平台是源于患者的肿瘤样细胞簇，微肿瘤PTC体外模型；所述天然产物包括所有天然产物；所述肿瘤包含所有实体肿瘤。
[0007]上述微肿瘤PTC体外模型，在肿瘤微环境模拟方面具有优势。
[0008]上述源于患者的肿瘤样细胞簇，包括肿瘤来源的上皮细胞、间质细胞、免疫细胞，具有组织特异性以及干细胞特性。
[0009]上述微肿瘤PTC体外模型与原始肿瘤组织在表观层面以及遗传特征方面具有一致性，其临床一致性和培养成功率均可以达到90％以上。
[0010]上述天然产物可为华蟾素。所述华蟾素为华蟾素片提取物。
[0011]上述肿瘤包含除血液肿瘤的所有实体肿瘤。所述实体肿瘤可为肺癌。
[0012]上述抗肿瘤活性可表现为PTC微球细胞活力测定。
[0013]上述抗肿瘤活性可表现为肿瘤样细胞簇的退缩程度。
[0014]上述观察肿瘤样细胞簇退缩程度可通过显微镜以及AI智能软件计数统计。
[0015]本专利技术与现有技术相比较优势在于：
[0016]本专利技术首次利用微肿瘤PTC体外模型作为筛选平台，该平台最终结果可通过AI智能软件统计分析，可缩短筛选周期，降低成本，提高准确性；该平台可在短时间内进行高通量筛选，同时可以探索具有抗肿瘤活性的天然产物与其他化疗、靶向、免疫等药物的协同作用，研究其治疗疗效。
附图说明
[0017]图1是本专利技术具体实施例1的肺癌患者来源的PTC微球培养7天内的生长情况。
[0018]图2是本专利技术具体实施例1的肺癌患者来源的PTC微球培养D0时HE染色鉴定
[0019]图3是本专利技术具体实施例1的肺癌患者来源的PTC微球加药后D0时实验组与对照组镜下与AI计数图(实验组以1
‑
1为例)
[0020]图4是本专利技术具体实施例1的肺癌患者来源的PTC微球加药后D3时实验组与对照组镜下与AI计数图(实验组以1
‑
1为例)
[0021]图5是本专利技术具体实施例1的肺癌患者来源的PTC微球加药后D7时实验组与对照组镜下与AI计数图(实验组以1
‑
1为例)
[0022]图6是本专利技术具体实施例1的肺癌患者来源的PTC微球加药后对照组与试验组数量柱状图
[0023]图7是本专利技术具体实施例1的测定肺癌患者来源的PTC微球加药后D7时的细胞活力
具体实施方式
[0024]下面将对本专利技术的技术方案作进一步说明，但本专利技术并不仅限于此。
[0025]实施例1
[0026]本实施例所述的源于患者的肿瘤样细胞簇为肺癌细胞簇，所述天然产物为华蟾素，英文名称：Cinobufotalin，化学式为：所述方法为采用物理剪切、酶消化将肺癌实验样本解离为单个肿瘤细胞，经过7天后，细胞可通过增殖以及自组装形成PTC微球；华蟾素片提取物可有效杀伤肺癌PTC微球，使其数量明显减少，体积明显的缩小。
[0027]将收集肺癌患者胸水样本分装在离心管中，进行离心。经PBs吹洗、重悬离心后，吸取中间层至离心管中；离心后弃去上清，然后再6孔板或12孔板中，加入特定肺癌培养基中。
[0028]将前处理完成后样本置于恒温培养箱培养3
‑
7后，细胞通过自组装和扩增形成PTC
微球。在培养过程中，分别在D0、D3、D7时镜下拍照计数。如图1。
[0029]将前处理完成的细胞液吸取100ul用于HE染色鉴定；先用tritonX 100进行透化，然后用苏木素染核，1～3min后用流水漂洗，接下来用1％盐酸酒精分化数秒，然后用流水漂洗，再用氨水返蓝1min后流水冲洗，伊红染质0.5～1min后流水漂洗，最后，用75％乙醇2min，85％乙醇2min，无水乙醇5min，无水乙醇5min，二甲苯5min，进行逐级脱水，中性树脂封片后于镜下鉴定为肿瘤细胞；如图2。
[0030]将培养完成后的PTC微球铺于96孔板中。华蟾素片提取物根据试验剂量由高到低进行分组，每个试验组铺3个重复孔，设一组对照组(3个重复孔)。按试验剂量添加华蟾素片提取物，分别观察24小时、48小时、72小时以及第7天时的肿瘤退缩程度，包括数量和体积变化。并拍照，用AI计数统计。如图3
‑
5。
[0031]将PTC微球与药物共孵育完成后的96孔板，稍微倾斜立起，沿液面小心吸去100ul上清，加入80ul celltitor，然后将混合液体从透明板移到白板中，移前充分吹洗混匀，设置摇床20峰站，速度中等进行摇匀。转移后用分光光度计测定其细胞活力值；如图7。
[0032]本专利技术结果显示，华蟾素片提取物可杀伤PTC微球，使其数量明显减少，体积明显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型抗肿瘤天然产物的筛选平台及其应用，其中，所述新型抗肿瘤天然产物的筛选平台仅包括利用微肿瘤PTC平台进行筛选，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、收集源于恶性肿瘤患者的可供实验标本，构建微肿瘤PTC体外模型；步骤1、基于微肿瘤PTC体外模型对具有抗肿瘤作用的天然产物进行筛选。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恶性肿瘤包括但不限于胃肠肿瘤、乳腺癌、肺癌、肝胆肿瘤、妇科肿瘤、泌尿肿瘤、肉瘤，除血液肿瘤外的所有实体肿瘤。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤1中的可供实验标本，包括但不限于手术组织、穿刺组织、活检组织或者胸腹水。4.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：路威，潘雨琪，孙志学，
申请(专利权)人：浙江基石精准医学有限公司，
类型：发明
国别省市：