一种精准可控的先天性脊柱侧弯动物模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，提供了一种通过显微操作精准控制椎骨畸形发生部位的先天性脊柱侧弯动物模型的构建方法。本发明专利技术通过对发育中的鸡胚定向植入非通透性材料，阻断其特定发育时期调控特定椎骨发育的信号传导，使该椎骨形成发育性畸形，并在非干预部位维持正常发育。椎骨畸形的位置精准可控地构建在设定的位置，使得该脊柱侧弯模型的构建更具有针对性，有利于分别在颈椎、胸椎、腰椎等不同节段研究先天性脊柱侧弯形成的分子调控机制。本发明专利技术解决了目前尚无法获得精准、可控、有选择性地构建颈、胸、腰各节段的先天性脊柱侧弯动物模型的难题，为研究先天性脊柱侧弯发病机制提供了可靠的工具。了可靠的工具。了可靠的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种精准可控的先天性脊柱侧弯动物模型的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种精准可控的先天性脊柱侧弯动物模型的构建方法。

技术介绍

[0002]脊柱侧弯是脊柱失去正常的生理曲度，出现脊柱序列异常弯曲与椎骨旋转的脊柱三维畸形。脊柱侧弯主要包括特发性脊柱侧弯、先天性脊柱侧弯（congenial scoliosis，CS）和神经肌肉型脊柱侧弯等，可造成脊柱、肋骨及胸廓的畸形损害，严重影响患者身心健康。CS 是脊柱侧弯当中的较为重要的一大类，发病率为 0.5
‰
～1
‰
，其发病年龄最早，椎体旋转严重，脊柱僵硬且畸形进展迅速。临床上 CS 可分为 3 型：I型:椎体形成障碍，包括半椎体、蝴蝶椎；II型:椎体分节不良，包括块状椎、阻滞椎或骨桥；III型:混合型（合并I型与II型的症状）。目前CS的病因尚不清晰，关键分子调控机制尚不明确，而又缺乏高效便捷的CS动物模型工具，不同程度地制约着CS的病因及机制的研究进展。
[0003]目前已有的构建脊柱侧弯动物模型的方法，比如：（1）脊柱内、外拴系方法，将幼年大鼠的肩胛下角与躯体同侧骨盆拴系，或者将相邻肋骨拴系，或者佩戴侧弯背心模具，制造出特发性脊柱侧弯；（2）手术切除松果体法，通过手术切除小鼠或鸡的松果体切除，减少褪黑素的释放，进而引起脊柱侧弯；其构建的特发性脊柱侧弯动物模型，与拥有椎骨畸形的先天性脊柱侧弯相去甚远，不适合用于研究先天性脊柱侧弯的发病机制。
[0004]现有的构建先天性脊柱侧弯动物模型的方法主要包括三种：基因编辑、限制营养物质摄入和暴露于缺氧环境。利用基因编辑构建CS模型，是通过敲除先天性脊柱侧弯的易感基因（TBX6、DLL3、MESP2、LFNG、HES7 等），从而构建先天性脊柱侧弯模型小鼠。该构建方法方便研究探索遗传因素对脊柱侧弯的影响，但是其先天性脊柱侧弯发生的位置不可控，无法准确构建颈椎、胸椎或者腰椎椎骨畸形的先天性脊柱侧弯动物模型，会限制研究人员对不同脊柱节段侧弯形成的分子调控机制或其余相关相伴随症状（如心肺功能影响）的研究。通过限制营养物质摄入构建 CS 模型，是对孕期雌鼠限制维生素 A 的摄入，导致维生素Ａ缺乏，可导致 CS的发生（维生素 A 可转换为视黄酸，后者在胚胎时期骨软骨发育起重要作用），该方法构建的模型可以模拟孕期营养不足或维生素摄入不足所致的 CS，但是，同样无法控制脊柱畸形发生的位置。通过暴露于缺氧环境构建 CS 模型，是给予妊娠期雌鼠制造子宫内缺氧环境，或者使妊娠期雌鼠暴露于一氧化碳环境中（一氧化碳与氧竞争血红蛋白结合位点，干扰组织氧合作用，导致缺氧环境），可构建子代小鼠的 CS 模型，该方法适合研究新生儿宫内缺氧所致的 CS，但因小鼠为爬行动物，无法站立行走，故无法模拟出重力对脊柱侧弯曲度的影响，同样也无法控制脊柱侧弯发生的位置。
[0005]现有的脊柱侧弯动物模型的构建方法无法控制脊柱侧弯发生的位置，制约着对不同节段先天性脊柱侧弯的特异发病机制的研究。因此，十分有必要研究出精准、可控、可选择地构建颈椎、胸椎、腰椎椎骨畸形的先天性脊柱侧弯动物模型。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供一种精准可控的先天性脊柱侧弯动物模型的构建方法，以及利用该构建方法构建的先天性脊柱侧弯动物模型和应用，旨在提供精准、可控、可选择地构建颈椎、胸椎、腰椎椎骨畸形的先天性脊柱侧弯动物模型，弥补现有脊柱侧弯发生位置不可控制的脊柱侧弯动物模型的缺陷，为先天性脊柱侧弯的研究提供更精准的动物模型工具。
[0007]本专利技术通过对处于发育过程中的鸡蛋胚胎定向植入非通透性材料，阻断特定发育时期调控特定脊柱椎骨发育的信号传导，保持其他非干预位置以及对侧的脊柱节段相对正常，把椎骨畸形的位置精准可控地构建在设定的位置，使得先天性脊柱侧弯模型的构建更有针对性，从而精准构建颈椎、胸椎、腰椎的先天性脊柱侧弯模型，实现分节段研究颈椎、胸椎、腰椎的先天性脊柱侧弯形成的分子调控机制。本专利技术解决了目前尚无法精准、可控、有选择性地构建颈、胸、腰各节段的先天性脊柱侧弯动物模型的难题。
[0008]本专利技术选择鸡作为模型动物，其一：鸡受精卵方便入手，可处于体外环境下孵化，在蛋壳上开窗即可实施胚胎操作，并且术后可持续孵化并动态观察鸡胚的发育；继而实现选择性地在鸡胚脊柱的不同发育时期、不同脊柱节段，精准可控地通过显微操作插入 PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）薄膜等非通透性材料，在胚胎发育早期干预组织间相互作用，构建颈椎、胸椎或腰椎椎骨畸形的先天性脊柱侧弯模型；而这些则是其他哺乳动物模型难以实现的；其二：鸡蛋成本低、孵化条件简单、孵化周期短，能够较为便捷、高效地获得颈、胸、腰各节段椎骨畸形的先天性脊柱侧弯动物模型；其三：相比于四足动物，鸡可站立行走，脊柱受重力影响，更真实准确地模拟人体在直立行走时脊柱承受重力影响的情况下侧弯的病程演变。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供了一种椎骨畸形形成部位精准可控的先天性脊柱侧弯动物模型的构建方法，对发育中的鸡胚定向植入非通透性材料，阻碍颈椎、胸椎和/或腰椎发育时期椎骨的发育（阻断颈椎、胸椎和/或腰椎发育时期调控椎骨发育的单侧信号的传导），待鸡胚的骨骼形成或胚胎发育完毕，即得。
[0010]利用所述构建方法阻断颈椎发育时期调控椎骨发育的单侧信号的传导，阻碍颈椎的发育，待鸡胚的骨骼形成或胚胎发育完毕，即得先天性颈椎侧弯动物模型。
[0011]利用所述构建方法阻断胸椎发育时期调控椎骨发育的单侧信号的传导，阻碍胸椎的发育，待鸡胚的骨骼形成或胚胎发育完毕，即得先天性胸椎侧弯动物模型。
[0012]利用所述构建方法阻断腰椎发育时期调控椎骨发育的单侧信号的传导，阻碍腰椎的发育，待鸡胚的骨骼形成或胚胎发育完毕，即得先天性腰椎侧弯动物模型。
[0013]利用所述构建方法阻碍颈椎、胸椎和/或腰椎发育时期椎骨的发育，可对单个椎骨或多个椎骨进行畸形诱导。
[0014]本专利技术的构建方法能够构建出与临床分型（I型、II型、III型）高度相似的先天性脊柱侧弯模型，且能够批量、产业化构建并用于先天性脊柱侧弯的科学研究，本专利技术的构建方法不存在动物实验伦理学限制。
[0015]优选地，所述非通透性材料为能够阻碍颈椎发育时期、胸椎发育时期和/或腰椎发育时期椎骨发育（阻断颈椎、胸椎和/或腰椎发育时期调控椎骨发育的单侧信号的传导）的信号传导的任一材料。
[0016]进一步优选地，所述非通透性材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜、保鲜膜等。选择插入的非通透性材料时，必须实施对照实验。卵黄膜拨开后，将所选材料放置胚胎背侧后继续孵化至实验所需发育阶段，观察胚胎是否发生发育异常，以确认该插入物的可用性。非通透性材料首先要保证无毒，其次还需要做前期实验，证明插入物本身不会诱发畸形。
[0017]优选地，所述非通透性材料厚度为0.002～0.003mm。
[0018]优选地，所述聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜为镀铝薄膜。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种椎骨畸形形成部位精准可控的先天性脊柱侧弯动物模型的构建方法，其特征在于，对鸡胚定向植入非通透性材料，阻碍颈椎发育时期、胸椎发育时期和/或腰椎发育时期椎骨的发育，待鸡胚骨骼形成或胚胎发育完毕，即可得相应位置脊柱侧弯的动物模型。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述定向植入是指在鸡胚的体节与神经管和脊索之间植入。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，可分别或同时在颈、胸、腰各节段诱发畸形，所述定向植入的位置是在鸡胚第14～19体节、第19～25体节和/或第26～30体节中的单侧体节与神经管和脊索之间植入。4.如权利要求1至3任一所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将鸡蛋孵化至颈椎发育时期、胸椎发育时期或腰椎发育时期；然后，通过显微操作将颈椎发育时期、胸椎发育时期和/或腰椎发育时期鸡胚的颈段、胸段和/或腰段的单侧体节与神经管和脊索之间的连接切开，定向植入非通透性材料插片；接着，封闭蛋壳上显微操作窗口，保持鸡蛋内环境稳定，继续孵化...

【专利技术属性】
技术研发人员：范海明，吴太林，罗建周，李琳，关斌，杨子立，段春光，陶惠人，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：