经工程化以减轻高苯丙氨酸血症的微生物制造技术

公开了遗传工程化细菌、其药物组合物以及调节和治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病的方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】(Sarkissian等人,1999)。聚乙二醇化形式的重组PAL(PEG
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PAL)作为一种可注射治疗形式，也在开发中。然而，大多数服用PEG
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PAL的受试者遭受了注射部位反应和/或产生了针对这种治疗酶的抗体(Longo等人,2014年)。因此，对用于与包括PKU在内的高苯丙氨酸血症相关的疾病的有效、可靠和/或长期治疗的需求仍未得到满足。对在允许消耗更多天然蛋白质的同时控制患者血液Phe水平的治疗的需求仍未得到满足。
[0008]在一些实施方案中，本公开提供了突变型PAL多肽和多核苷酸。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌(P.luminescens)PAL)相比，突变型PAL表现出稳定性增加和/或代谢苯丙氨酸和/或减轻高苯丙氨酸血症的能力增加。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌PAL)相比，突变型PAL多肽包含在氨基酸位置92、133、167、432、470、433、263、366和/或396处的一个或多个突变。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌PAL)相比，突变型PAL多肽包含在氨基酸位置S92、H133、I167、L432、V470、A433、A263、K366和/或L396处的一个或多个突变。
[0009]在一些实施方案中，本公开提供了产生突变型PAL的遗传工程化微生物，例如细菌。在一些实施方案中，工程化微生物还包含编码苯丙氨酸转运蛋白例如PheP的基因。在一些实施方案中，工程化微生物还可包含编码L
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氨基酸脱氨酶(LAAD)的基因。工程化微生物还可含有一个或多个与生物安全和/或生物防护相关的基因序列。任何这些基因序列在基因表达系统中的表达可以用合适的启动子或启动子系统来调节。
[0010]在某些实施方案中，遗传工程化微生物是非致病性的，并且可以被引入到肠道中以降低苯丙氨酸的毒性水平。本公开还提供了包含遗传工程化微生物的药物组合物，以及调节和治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病的方法。在一些实施方案中，包含突变型PAL的遗传工程化细菌包含一个或多个噬菌体基因组，其中噬菌体基因组中的一种或多种是有缺陷的，例如，使得不产生裂解性噬菌体。
[0011]附图简述
[0012]图1描绘了通过TCA测量的mPAL1、mPAL2和mPAL3的苯丙氨酸代谢。
[0013]图2描绘了与野生型PAL3相比，mPAL1、mPAL2和mPAL3的苯丙氨酸代谢。
[0014]图3A
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3B描绘了野生型PAL3、mPAL1、mPAL2和mPAL3的米氏图(Michaelis
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Menten graph)。
[0015]图4A
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C描绘了通过全细胞和细胞裂解物测定确定的野生型PAL3活性的TCA反馈抑制。
[0016]图5A
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B描绘了示例性pheP构建体的组织。
[0017]图6A
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B描绘了示例性PAL构建体的组织。
[0018]图7描绘了具有单个和多个染色体PAL插入的菌株中的TCA速率产生。
[0019]图8描绘了SYNB1934(本文中也称为SYN7701)(冻干批次)中的TCA速率产生。
[0020]图9描绘了SYNB1934中的TCA速率产生(来自冻干全细胞的裂解物)。
[0021]图10描绘了不同发酵过程(SYNB1618、SYN7701)中的体外活性。
[0022]图11A
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E描绘了SYNB1934在非人灵长类动物中的活性。
[0023]图12A
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D描述了SYNB1934在非人灵长类动物(D5
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Phe、D5
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HA、D5
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TCA)中的活性。
具体实施方式
[0024]本公开尤其包括突变型PAL多肽和多核苷酸。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌(P.luminescens)PAL)相比，突变型PAL表现出稳定性增加和/或代谢苯丙氨酸和/或减轻高苯丙氨酸血症的能力增加。本公开还包括包含突变型PAL的遗传工程化微生物、其药物组合物以及调节和治疗与高苯丙氨酸血症相关的病症(例如PKU)的方法。
[0025]为了能够更容易地理解本公开，首先定义某些术语。应当根据本公开的其余部分并如本领域普通技术人员所理解的来解读这些定义。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。附加定义如整个具体实施方式中所阐述。
[0026]“高苯丙氨酸血症(Hyperphenylalaninemia)”、“高苯丙氨酸血症的(hyperphenylalaninemic)”和“过量苯丙氨酸(excess phenylalanine)”在本文中可互换使用，是指体内苯丙氨酸浓度增加或异常高。在一些实施方案中，高苯丙氨酸血症的诊断信号是至少2mg/dL、至少4mg/dL、至少6mg/dL、至少8mg/dL、至少10mg/dL、至少12mg/dL、至少14mg/dL、至少16mg/dL、至少18mg/dL、至少20mg/dL或至少25mg/dL的血液苯丙氨酸水平。如本文所用，与高苯丙氨酸血症相关的疾病包括但不限于苯丙酮尿症、经典或典型苯丙酮尿症、非典型苯丙酮尿症、永久性轻度高苯丙氨酸血症、非苯丙酮尿症高苯丙氨酸血症、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、辅因子缺乏症、二氢蝶啶还原酶缺乏症、四氢蝶呤合酶缺乏症和塞加瓦氏病(Segawa
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s disease)。受影响的个体可能会出现渐进性和不可逆的神经功能缺损、智力迟钝、脑病、癫痫、湿疹、生长迟缓、小头畸形、震颤、肢体痉挛和/或色素减退(Leonard 2006)。高苯丙氨酸血症也可继发于其他疾病，例如肝病。
[0027]“苯丙氨酸解氨酶”和“PAL”用于指将苯丙氨酸转化或加工成反式肉桂酸和氨的PME。反式肉桂酸毒性低，在哺乳动物中被肝酶转化为马尿酸，马尿酸分泌在尿液中。PAL可以代替PAH酶来代谢过量的苯丙氨酸。PAL酶活性不需要THB辅因子活性。在一些实施方案中，PAL由来自或衍生自原核物种的PAL基因编码。在替代性实施方案中，PAL由衍生自真核物种的PAL基因编码。在一些实施方案中，PAL由来自或衍生自细菌物种的PAL基因编码，所述细菌物种包括但不限于木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)、变异鱼腥藻(Anabaena variabilis)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。在一些实施方案中，PAL由衍生自多变鱼腥藻的PAL基因编码，并且在本文中称为“PAL1”(Moffitt等人,2007)。在一些实施方案中，PAL由衍生自发光光杆菌的PAL基因编码，并且在本文中称为“PAL3”(Wi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种突变型苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽，其包含与野生型PAL相比在选自92、133、167、432、470、433、263、366和396的氨基酸位置处的一个或多个突变。2.如权利要求1所述的突变型PAL多肽，其包含与野生型PAL相比在选自S92、H133、I167、L432、V470、A433、A263、K366和/或L396的氨基酸位置处的一个或多个突变。3.如权利要求1或2所述的突变型PAL多肽，其中所述野生型PAL是发光光杆菌PAL。4.如权利要求3所述的突变型PAL多肽，其中所述发光光杆菌PAL包含SEQ ID NO:1。5.如权利要求1
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4中任一项所述的突变型PAL多肽，其中所述突变包括S92G；H133M；I167K；L432I；V470A。6.如权利要求1
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4中任一项所述的突变型PAL多肽，其中所述突变包括S92G；H133F；A433S；V470A。7.如权利要求1
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4中任一项所述的突变型PAL多肽，其中所述突变包括S92G；H133F；A263T；K366K(例如，多核苷酸序列中的沉默突变)；L396L(例如，多核苷酸序列中的沉默突变)；V470A。8.如权利要求1
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7中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出代谢苯丙氨酸的能力增加。9.如权利要求1
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8中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少两倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。10.如权利要求1
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9中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少三倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。11.如权利要求1
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10中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少四倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。12.如权利要求1
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11中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少五倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。13.如权利要求8
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12中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比代谢苯丙氨酸的能力增加是通过检测苯丙氨酸、马尿酸和/或反式肉桂酸的水平来测量的。14.一种多核苷酸，其编码如权利要求1
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13中任一项所述的突变型PAL多肽。15.一种基因表达系统，其包括如权利要求14所述的多核苷酸。16.如权利要求15所述的基因表达系统，其中编码突变型PAL的多核苷酸可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。17.如权利要求16所述的基因表达系统，其中所述启动子是诱导型启动子。18.如权利要求17所述的基因表达系统，其中所述诱导型启动子是温度调节型启动子。19.如权利要求17所述的基因表达系统，其中所述诱导型启动子是氧水平依赖型启动子。20.如权利要求19所述的基因表达系统，其中所述氧水平依赖型启动子包括延胡索酸和硝酸还原酶调节剂(FNR)启动子、精氨酸脱亚胺酶和硝酸还原(ANR)启动子和异化硝酸呼吸调节剂(DNR)启动子。21.如权利要求15
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20中任一项所述的基因表达系统，其还包括编码野生型PAL的基因。22.如权利要求21所述的基因表达系统，其中所述野生型PAL可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。
23.如权利要求15
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22中任一项所述的基因表达系统，其还包含编码L
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氨基酸脱氨酶(LAAD)的基因。24.如权利要求23所述的基因表达系统，其中所述编码LAAD的基因可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。25.如权利要求15
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24中任一项所述的基因表达系统，其还包含编码苯丙氨酸转运蛋白的基因。26.如权利要求25所述的基因表达系统，其中所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。27.一种遗传工程化微生物，其包含编码如权利要求1
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13中任一项所述的突变型PAL多肽的一个或多个基因或如权利要求15
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26中任一项所述的基因表达系统。28.一种遗传工程化微生物，其包含编码如权利要求1
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13中任一项所述的突变型PAL的一个或多个基因，其中所述突变型PAL可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。29.如权利要求28所述的遗传工程化微生物，其中所述启动子是诱导型启动子。30.如权利要求29所述的遗传工程化微生物，其中所述诱导型启动子是温度调节型启动子。31.如权利要求29所述的遗传工程化微生物，其中所述诱导型启动子是氧水平依赖型启动子。32.如权利要求31所述的遗传工程化微生物，其中所述氧水平依赖型启动子包括FNR、ANR和DNR启动子。33.如权利要求28
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32中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含编码野生型PAL的基因。34.如权利要求33所述的遗传工程化微生物，其中编码所述野生型PAL的所述基因可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。35.如权利要求28
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34中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含编码LAAD的基因。36.如权利要求35所述的遗传工程化微生物，其中所述LAAD可操作地连接至不与所述基因天然缔合的诱导型启动子。37.如权利要求28
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36中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含编码苯丙氨酸转运蛋白的基因。38.如权利要求37所述的遗传工程化微生物，其中所述苯丙氨酸转运蛋白可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。39.一种遗传工程化微生物，其包含：(a)编码如权利要求1
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13中任一项所述的突变型PAL多肽的一个或多个基因，其中所述多肽可操作地连接至不与所述基因天然缔合的温度调节型启动子或氧水平依赖型启动子；(b)编码苯丙氨酸转运蛋白的一个或多个基因，其中编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述基因可操作地连接至不与所述基因天然缔合的诱导型启动子；以及任选地(c)编码L
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氨基酸脱氨酶(LAAD)的一个或多个基因，其中编码所述LAAD的所述一个或多个基因可操作地连接至不与所述一个或多个基因天然缔合的诱导型启动子。40.如权利要求38或39所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述
一个或多个基因的所述启动子是同一启动子的独立拷贝。41.如权利要求38或39所述的遗传工程化微生物，其中编码所述PAL的所述一个或多个基因和编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因可操作地连接至同一启动子的同一拷贝。42.如权利要求36
‑
41中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述一个或多个基因可操作地连接的启动子不同于可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子。43.如权利要求36
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42中任一项所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子、可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述LAAD的所述一个或多个基因的所述启动子由外源环境条件诱导。44.如权利要求38
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43中任一项所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子由哺乳动物肠道中发现的外源环境条件诱导。45.如权利要求44所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子由哺乳动物小肠中发现的外源环境条件诱导。46.如权利要求38
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45中任一项所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子选自由以下组成的组：在低氧或厌氧条件下诱导的启动子、温度调节型启动子和由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导的启动子。47.如权利要求46所述的遗传工程化微生物，其中可操作连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子是FNR响应性启动子。48.如权利要求36
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47中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因受到由哺乳动物肠道中天然存在的环境因子诱导的启动子控制。49.如权利要求36
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47中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因受到由哺乳动物肠道中非天然存在的环境因子诱导的启动子控制。50.如权利要求49所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因受到由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导的启动子控制。51.如权利要求37
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50中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述基因位于所述微生物的染色体上。52.如权利要求37
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50中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述基因位于所述微生物的质粒上。52.如权利要求28
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52中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述PAL的所述基因位于所述微生物的质粒上。53.如权利要求28
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52中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述PAL的所述基因位于所述微生物的染色体上。54.如权利要求35
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53中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基
因位于所述微生物的质粒上。55.如权利要求35
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53中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因位于所述微生物的染色体上。56.如权利要求37
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55中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述苯丙氨酸转运蛋白是PheP。57.如权利要求27
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56中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述微生物是当所述微生物存在于哺乳动物肠道中时是互补的基因的营养缺陷型。58.如权利要求57所述的遗传工程化微生物，其中所述哺乳动物肠道是人类肠道。59.如权利要求58所述的遗传工程化微生物，其中所述微生物是胸苷生物合成途径中的二氨基庚二酸或酶营养缺陷型的。60.如权利要求27
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59中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述微生物进一步被工程化以含有编码对所述微生物有毒的物质的基因，其中所述基因受到由哺乳动物肠道中非天然存在的环境因子诱导的启动子控制。61.如权利要求30和33
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60中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述温度调节型启动子在37℃与42℃之间的温度下被诱导。62.如权利要求61所述的遗传工程化微生物，其中所述温度调节型启动子是λCI诱导型启动子。63.如权利要求61或62所述的遗传工程化微生物，其还包含编码温度敏感性CI阻遏物突变体的一个或多个基因。64.如权利要求63所述的遗传工程化微生物，其中所述温度敏感性CI阻遏物突变体是CI857。65.如权利要求63或64所述的遗传工程化微生物，其中编码所述温度敏感性CI阻遏物突变体的所述一个或多个基因受到FNR响应性启动子或由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导的启动子控制。66.如权利要求36
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62中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含温度敏感型CI阻遏物突变体，其中编码所述LAAD的所述基因和编码所述温度敏感型CI阻遏物突变体的所述基因受到同一启动子控制。67.如权利要求66所述的遗传工程化微生物，其中所述启动子由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖的存在直接或间接诱导。68.如权利要求36
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48和51
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66中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因受到FNR响应性启动子控制。69.如权利要求63
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68中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述温度敏感性CI阻遏物突变体的所述基因位于所述微生物中的质粒上。70.如权利要求63
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68中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述温度敏感性CI阻遏物突变体的所述基因位于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：同生运营公司，
类型：发明
国别省市：