经工程化以减轻高苯丙氨酸血症的微生物制造技术

公开了遗传工程化细菌、其药物组合物以及调节和治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病的方法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经工程化以减轻高苯丙氨酸血症的微生物
[0001]本申请要求2020年3月20日提交的美国临时申请第62/992,637号和2020年4月30日提交的美国临时申请第63/017,755号的权益，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
[0002]本公开涉及用于减轻高苯丙氨酸血症的组合物和治疗方法。在某些方面，本公开涉及能够减轻哺乳动物中的高苯丙氨酸血症的遗传工程化微生物，例如细菌。在某些方面，本文公开的组合物和方法可用于治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病，例如苯丙酮尿症。
[0003]苯丙氨酸是一种必需氨基酸，主要存在于膳食蛋白质中。通常，少量用于蛋白质合成，并且剩余部分在需要苯丙氨酸羟化酶(PAH)和辅因子四氢生物蝶呤的酶促途径中羟基化为酪氨酸。高苯丙氨酸血症是一组与会有毒性并导致脑损伤的苯丙氨酸水平过量相关的疾病。原发性高苯丙氨酸血症是由PAH基因突变和/或辅因子代谢阻滞导致的PAH活性缺乏引起的。
[0004]苯丙酮尿症(PKU)是一种由PAH基因突变引起的严重形式的高苯丙氨酸血症。PKU是一种常染色体隐性遗传病，是世界范围内最常见的先天性代谢缺陷(每3000名新生儿中有1例)，并且在美国影响着大约13000名患者。已经确定了400多种不同的PAH基因突变(Hoeks等人,2009)。血液中苯丙氨酸(phe)的积累会对儿童和成人的中枢神经系统造成严重损害。如果新生儿未经治疗，PKU会导致不可逆的脑损伤。目前对PKU的治疗包括从饮食中完全排除苯丙氨酸。大多数天然蛋白质来源都含有苯丙氨酸，这是一种必需氨基酸并且也是生长所必需的。在PKU患者中，这意味着他们依赖医疗食品和不含phe的蛋白质补充剂以及氨基酸补充剂来提供足够的苯丙氨酸用于生长。这种饮食对患者来说很困难并对生活质量有影响。
[0005]如所讨论，目前的PKU疗法需要由蛋白质限制组成的实质上改造的饮食。从出生开始治疗通常会减少脑损伤和精神发育迟滞(Hoeks等人,2009年；Sarkissian等人,1999年)。然而，必须仔细监控蛋白质限制性饮食，并且必须在饮食中补充必需氨基酸以及维生素。此外，获取低蛋白食品是一个挑战，因为它们比高蛋白、未改造对应物更昂贵(Vockley等人,2014)。
[0006]在患有PKU的儿童中，低苯丙氨酸饮食导致的生长迟滞很常见(Dobbelaere等人,2003)。成年后，可能会出现新的问题，诸如骨质疏松症、母体PKU和维生素缺乏症(Hoeks等人,2009)。血液中可自由穿透血脑屏障的苯丙氨酸水平过量也可导致神经损伤、行为问题(如易怒、疲劳)和/或身体症状(如惊厥、皮疹、身体霉味)。国际指南建议终身饮食苯丙氨酸限制，这被广泛认为是困难和不现实的(Sarkissian等人,1999)，并且“需要继续努力克服带着PKU生活的最大挑战
‑
终身坚持低苯丙氨酸饮食”(Macleod等人,2010)。
[0007]在具有残余PAH活性的患者亚组中，口服施用辅因子四氢生物蝶呤(也称为THB、BH4、Kuvan或沙丙蝶呤)可以与饮食限制一起使用，以降低血液苯丙氨酸水平。然而，辅因子疗法是昂贵的，并且仅适用于轻度形式的苯丙酮尿症。例如，Kuvan的年度费用可能高达每位患者57,000美元。此外，Kuvan的副作用可包括胃炎和严重过敏反应(例如，喘息、头晕、恶心、皮肤潮红)。
[0008]苯丙氨酸解氨酶(PAL)能够将苯丙氨酸代谢成无毒水平的氨和反式肉桂酸。与PAH不同，PAL不需要THB辅因子活性来代谢苯丙氨酸。已经对使用PAL的口服酶疗法进行了研究，但是“没有继续进行人类和甚至动物研究，因为PAL不能以合理的成本获得足够的量”(Sarkissian等人,1999)。聚乙二醇化形式的重组PAL(PEG
‑
PAL)作为一种可注射治疗形式，也在开发中。然而，大多数服用PEG
‑
PAL的受试者遭受了注射部位反应和/或产生了针对这种治疗酶的抗体(Longo等人,2014年)。因此，对用于与包括PKU在内的高苯丙氨酸血症相关的疾病的有效、可靠和/或长期治疗的需求仍未得到满足。对在允许消耗更多天然蛋白质的同时控制患者血液Phe水平的治疗的需求仍未得到满足。
[0009]在一些实施方案中，本公开提供了突变型PAL多肽和多核苷酸。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌(P.luminescens)PAL)相比，突变型PAL表现出稳定性增加和/或代谢苯丙氨酸和/或减轻高苯丙氨酸血症的能力增加。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌PAL)相比，突变型PAL多肽包含在氨基酸位置92、133、167、432、470、433、263、366和/或396处的一个或多个突变。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌PAL)相比，突变型PAL多肽包含在氨基酸位置S92、H133、I167、L432、V470、A433、A263、K366和/或L396处的一个或多个突变。
[0010]在一些实施方案中，本公开提供了产生突变型PAL的遗传工程化微生物，例如细菌。在一些实施方案中，工程化微生物还包含编码苯丙氨酸转运蛋白例如PheP的基因。在一些实施方案中，工程化微生物还可包含编码L
‑
氨基酸脱氨酶(LAAD)的基因。工程化微生物还可含有一个或多个与生物安全和/或生物防护相关的基因序列。任何这些基因序列在基因表达系统中的表达可以用合适的启动子或启动子系统来调节。
[0011]在某些实施方案中，遗传工程化微生物是非致病性的，并且可以被引入到肠道中以降低苯丙氨酸的毒性水平。本公开还提供了包含遗传工程化微生物的药物组合物，以及调节和治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病的方法。在一些实施方案中，包含突变型PAL的遗传工程化细菌包含一个或多个噬菌体基因组，其中噬菌体基因组中的一种或多种是有缺陷的，例如，使得不产生裂解性噬菌体。
[0012]附图简述
[0013]图1描绘了通过TCA测量的mPAL1、mPAL2和mPAL3的苯丙氨酸代谢。
[0014]图2描绘了与野生型PAL3相比，mPAL1、mPAL2和mPAL3的苯丙氨酸代谢。
[0015]图3A
‑
3B描绘了野生型PAL3、mPAL1、mPAL2和mPAL3的米氏图(Michaelis
‑
Menten graph)。
[0016]图4A
‑
4C描绘了在食蟹猴模型中突变型PAL功效的体外研究。通过测定血浆TCA和尿中马尿酸的水平来测量PAL变体的活性。
[0017]图5A
‑
5C描绘了通过全细胞和细胞裂解物测定确定的野生型PAL3活性的TCA反馈抑制。
具体实施方式
[0018]本公开尤其包括突变型PAL多肽和多核苷酸。在一些实施方案中，与野生型PAL(例如发光光杆菌PAL)相比，突变型PAL表现出稳定性增加和/或代谢苯丙氨酸和/或减轻高苯丙氨酸血症的能力增加。本公开还包括包含突变型PAL的遗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种突变型苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽，其包含与野生型PAL相比在选自92、133、167、432、470、433、263、366和396的氨基酸位置处的一个或多个突变。2.如权利要求1所述的突变型PAL多肽，其包含与野生型PAL相比在选自S92、H133、I167、L432、V470、A433、A263、K366和/或L396的氨基酸位置处的一个或多个突变。3.如权利要求1或2所述的突变型PAL多肽，其中所述野生型PAL是发光光杆菌PAL。4.如权利要求3所述的突变型PAL多肽，其中所述发光光杆菌PAL包含SEQ ID NO:#。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的突变型PAL多肽，其中所述突变包括S92G；H133M；I167K；L432I；V470A。6.如权利要求1
‑
4中任一项所述的突变型PAL多肽，其中所述突变包括S92G；H133F；A433S；V470A。7.如权利要求1
‑
4中任一项所述的突变型PAL多肽，其中所述突变包括S92G；H133F；A263T；K366K(例如，多核苷酸序列中的沉默突变)；L396L(例如，多核苷酸序列中的沉默突变)；V470A。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出代谢苯丙氨酸的能力增加。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少两倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。10.如权利要求1
‑
9中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少三倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少四倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。12.如权利要求1
‑
11中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比，所述多肽表现出至少五倍的代谢苯丙氨酸的能力增加。13.如权利要求8
‑
12中任一项所述的突变型PAL多肽，其中与所述野生型PAL相比代谢苯丙氨酸的能力增加是通过检测苯丙氨酸、马尿酸和/或反式肉桂酸的水平来测量的。14.一种多核苷酸，其编码如权利要求1
‑
13中任一项所述的突变型PAL多肽。15.一种基因表达系统，其包括如权利要求14所述的多核苷酸。16.如权利要求15所述的基因表达系统，其中编码突变型PAL的多核苷酸可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。17.如权利要求16所述的基因表达系统，其中所述启动子是诱导型启动子。18.如权利要求17所述的基因表达系统，其中所述诱导型启动子是IPTG诱导型启动子。19.如权利要求17所述的基因表达系统，其中所述诱导型启动子是温度调节型启动子或氧水平依赖型启动子。20.如权利要求19所述的基因表达系统，其中所述氧水平依赖型启动子包括延胡索酸和硝酸还原酶调节剂(FNR)启动子、精氨酸脱亚胺酶和硝酸还原(ANR)启动子和异化硝酸呼吸调节剂(DNR)启动子。21.如权利要求15
‑
20中任一项所述的基因表达系统，其还包括编码野生型PAL的基因。22.如权利要求21所述的基因表达系统，其中所述野生型PAL可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。
23.如权利要求15
‑
22中任一项所述的基因表达系统，其还包含编码L
‑
氨基酸脱氨酶(LAAD)的基因。24.如权利要求23所述的基因表达系统，其中所述编码LAAD的基因可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。25.如权利要求15
‑
24中任一项所述的基因表达系统，其还包含编码苯丙氨酸转运蛋白的基因。26.如权利要求25所述的基因表达系统，其中所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。27.一种遗传工程化微生物，其包含编码如权利要求1
‑
13中任一项所述的突变型PAL多肽的一个或多个基因或如权利要求15
‑
26中任一项所述的基因表达系统。28.一种遗传工程化微生物，其包含编码如权利要求1
‑
13中任一项所述的突变型PAL的一个或多个基因，其中所述突变型PAL可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。29.如权利要求28所述的遗传工程化微生物，其中所述启动子是诱导型启动子。30.如权利要求29所述的遗传工程化微生物，其中所述诱导型启动子是IPTG诱导型启动子。31.如权利要求29所述的遗传工程化微生物，其中所述诱导型启动子是温度调节型启动子或氧水平依赖型启动子。32.如权利要求31所述的遗传工程化微生物，其中所述氧水平依赖型启动子包括FNR、ANR和DNR启动子。33.如权利要求28
‑
32中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含编码野生型PAL的基因。34.如权利要求33所述的遗传工程化微生物，其中编码所述野生型PAL的所述基因可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。35.如权利要求28
‑
34中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含编码LAAD的基因。36.如权利要求35所述的遗传工程化微生物，其中所述LAAD可操作地连接至不与所述基因天然缔合的诱导型启动子。37.如权利要求28
‑
36中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含编码苯丙氨酸转运蛋白的基因。38.如权利要求37所述的遗传工程化微生物，其中所述苯丙氨酸转运蛋白可操作地连接至不与所述基因天然缔合的启动子。39.一种遗传工程化微生物，其包含：(a)编码如权利要求1
‑
13中任一项所述的突变型PAL多肽的一个或多个基因，其中所述多肽可操作地连接至不与所述一个或多个基因天然缔合的IPTG诱导型启动子、温度调节型启动子或氧水平依赖型启动子；(b)编码苯丙氨酸转运蛋白的一个或多个基因，其中编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因可操作地连接至不与所述一个或多个基因天然缔合的诱导型启动子；以及任选地(c)编码L
‑
氨基酸脱氨酶(LAAD)的一个或多个基因，其中编码所述LAAD的所述一个或多个基因可操作地连接至不与所述一个或多个基因天然缔合的诱导型启动子。
40.如权利要求38或39所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子是同一启动子的独立拷贝。41.如权利要求38或39所述的遗传工程化微生物，其中编码所述PAL的所述一个或多个基因和编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因可操作地连接至同一启动子的同一拷贝。42.如权利要求36
‑
41中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述一个或多个基因可操作地连接的启动子不同于可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子。43.如权利要求36
‑
42中任一项所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子、可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述LAAD的所述一个或多个基因的所述启动子由外源环境条件诱导。44.如权利要求38
‑
43中任一项所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子由哺乳动物肠道中发现的外源环境条件诱导。45.如权利要求44所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述PAL的所述一个或多个基因的所述启动子和可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子由哺乳动物小肠中发现的外源环境条件诱导。46.如权利要求38
‑
45中任一项所述的遗传工程化微生物，其中可操作地连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子选自由以下组成的组：在低氧或厌氧条件下诱导的启动子、温度调节型启动子和由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导的启动子。47.如权利要求46所述的遗传工程化微生物，其中可操作连接至编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因的所述启动子是FNR响应性启动子。48.如权利要求36
‑
47中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因受到由哺乳动物肠道中天然存在的环境因子诱导的启动子控制。49.如权利要求36
‑
47中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因受到由哺乳动物肠道中非天然存在的环境因子诱导的启动子控制。50.如权利要求49所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述基因受到由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导的启动子控制。51.如权利要求37
‑
50中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因位于所述微生物中的染色体上。52.如权利要求37
‑
50中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述苯丙氨酸转运蛋白的所述一个或多个基因位于所述微生物中的质粒上。53.如权利要求28
‑
52中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述PAL的所述一个或多个基因位于所述微生物中的质粒上。54.如权利要求28
‑
52中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述PAL的所述一
个或多个基因位于所述微生物中的染色体上。55.如权利要求35
‑
54中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述一个或多个基因位于所述微生物中的质粒上。56.如权利要求35
‑
54中任一项所述的遗传工程化微生物，其中编码所述LAAD的所述一个或多个基因位于所述微生物中的染色体上。57.如权利要求37
‑
56中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述苯丙氨酸转运蛋白是PheP。58.如权利要求27
‑
57中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述微生物是当所述微生物存在于哺乳动物肠道中时是互补的基因的营养缺陷型。59.如权利要求58所述的遗传工程化微生物，其中所述哺乳动物肠道是人类肠道。60.如权利要求59所述的遗传工程化微生物，其中所述微生物是胸苷生物合成途径中的二氨基庚二酸或酶营养缺陷型的。61.如权利要求27
‑
60中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述微生物进一步被工程化以含有编码对所述微生物有毒的物质的基因，其中所述基因受到由哺乳动物肠道中非天然存在的环境因子诱导的启动子控制。62.如权利要求30和33
‑
61中任一项所述的遗传工程化微生物，其中所述温度调节型启动子在37℃与42℃之间的温度下被诱导。63.如权利要求62所述的遗传工程化微生物，其中所述温度调节型启动子是λCI诱导型启动子。64.如权利要求62或63所述的遗传工程化微生物，其还包含编码温度敏感性CI阻遏物突变体的一个或多个基因。65.如权利要求64所述的遗传工程化微生物，其中所述温度敏感性CI阻遏物突变体是CI857。66.如权利要求64或65所述的遗传工程化微生物，其中编码所述温度敏感性CI阻遏物突变体的所述一个或多个基因受到FNR响应性启动子或由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导的启动子控制。67.如权利要求36
‑
63中任一项所述的遗传工程化微生物，其还包含温度敏感型CI阻遏物突变体，其中编码所述LAAD的...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯汀，
申请(专利权)人：同生运营公司，
类型：发明
国别省市：