一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法技术

本发明专利技术公开了一种利用植物基因工程技术培育甘蔗抗逆新种质的方法。该法把担子菌灰树花的海藻糖合酶基因通过农杆菌介导法转入甘蔗的胚性细胞中，再通过胚状体成苗途径培育出完整的植株（转基因植株）。所获得的转基因植株由于能够合成和积累高水平的海藻糖，并表现出很强的抗逆性，在逆境条件下其比对照生长得好，而且产量和含糖量均得到了较大幅度的提高。利用该法培育甘蔗抗逆新种质具有培育周期短、效率高、成本低、不受外界条件影响等优点，其将加速我国甘蔗抗逆品种培育的进程，促进蔗糖业的发展，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种运用植物基因工程技术培育甘蔗抗逆种质的方法。
技术介绍
甘蔗(Saccharum officinarum L.)是全世界最为重要的糖料经济作物，也是我国热带、亚热带地区重要的糖料经济作物。目前我国是世界第3大产糖国，2003/2004榨季全国总产糖量达到1002万吨，其中甘蔗糖占总产糖量的94％。近年来甘蔗还发展成为一种重要的能源作物，是生产绿色燃料——酒精的重要原料。我国甘蔗主要种植于广西、云南、广东、福建、海南等十三个省区，种植面积已超过120万公顷，其中旱地甘蔗面积占90％左右。干旱和冷害是我国甘蔗生产面临的主要问题，因而培育抗逆甘蔗新品种尤为重要。由于现代甘蔗栽培种是甘蔗属热带种，割手密和印度种等物种的种间杂交种，在长期的高贵化育种过程中，减数分裂的异常使得现代甘蔗栽培种形成了大量的非整倍体，其染色体数量多、基因组结构复杂、在同株中染色体倍数不同，同时由于甘蔗对光周期反应敏感，许多重要亲本在亚热带和温带地区很难开花，即使开花花粉量也不足，而且经常与近缘植物的花期不遇，这给常规的抗逆育种带来许多困难，影响了甘蔗抗逆育种的进程。海藻糖具有极强的稳定蛋白质及细胞膜结构的功能，它能使生物体在许多异常情况下，如高温脱水(干燥、高渗透压)、冷冻时仍保持细胞内湿润，防止细胞因失水而造成细胞内养分的损失和细胞的损伤，从而使这些生物具有较强的抗旱、抗寒的能力。海藻糖在不同的生物体中具有不同的代谢途径，其相应的酶及作用的底物也不相同。如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)其海藻糖的合成均通过海藻糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶催化，合成途径为 在大肠杆菌中此二酶构成一个操纵子OtsBA，其中OtsA编码海藻糖-6-磷酸合酶，OtsB编码海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(Kassen等，1992)；而在酿酒酵母中此二酶由三个肽链组成，其中TPS1基因编码海藻糖-6-磷酸合酶、TPS2基因编码海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶、TPS3基因编码的旦白有利于酶复合体的聚集(Vuorio等，1992)。而在担子菌(Basidiomycete)灰树花(Grifola frandosa)中，海藻糖又是由海藻糖合酶(Tsase)催化合成，合成途径为(Saito等，1998) 到目前为止，国内外已获得几种转海藻糖合酶基因的抗逆转基因植物(如烟草、马铃薯、水稻和高羊茅等)，它们所利用的基因都是来源于细菌的OtsBA或酵母的TPS1基因。从上述不同生物体中海藻糖合成的途径可看出，灰树花中海藻糖合成的途径非常简单，且海藻糖合酶由单基因编码，用编码该酶的基因进行植物的遗传转化，因其表达调控相对简单，转基因植株合成海藻糖的效率会更高一些。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种培育甘蔗抗逆新种质材料的方法，它是利用植物基因工程技术把担子菌灰树花的海藻糖合酶基因通过农杆菌介导法转入甘蔗的胚性细胞中，再通过胚状体成苗途径培育出完整的具有抵抗逆境能力的植株(转基因植株)。本专利技术所设计的培育甘蔗抗逆新种质的方法包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌过程、农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程、转基因植株抗逆性鉴定和筛选过程。甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程以优良甘蔗栽培种幼嫩叶片基部为外植体，外植体先用乙醇进行表面消毒后再用氯化汞溶液进行消毒，之后用无菌水进行冲洗并用无菌滤纸吸干其表面的水分，然后将其切成薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，于避光条件下进行培养，以诱导胚性愈伤组织的产生。所述诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加有2，4-D、蔗糖。灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌的过程从担子菌灰树花(Grifola frondosa)的菌丝体中提取总RNA，并纯化出mRNA，再以mRNA为模板经反转录PCR(RT-PCR)扩增灰树花的海藻糖合酶基因的cDNA并进行测序，所得的片段即为灰树花的海藻糖合酶基因。之后把灰树花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表达载体pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰树花海藻糖合酶基因的植物表达载体pBBBT，该基因分别由串联的双拷贝CaMV35S启动子和逆境诱导表达启动子Prd29A驱动。最后采用三亲交配法将其导入农杆菌EHA105中。农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程取含有灰树花海藻糖合酶基因的农杆菌EHA105单菌落接种到含相应抗生素的YEP液体培养基中，振荡培养，通过离心回收菌体，再重悬于等体积含100-300μmol/L AS的MR液体培养基中继续震荡培养，以诱导细菌vir基因表达，此菌液即为转化用工程菌液。之后把处理过的胚性愈伤组织转入农杆菌菌液中，侵染后又用无菌吸水纸吸干菌液，再把胚性愈伤组织接种于MR固体培养基上于黑暗条件下培养，其后将胚性愈伤组织用无菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干水份后接种于含抗性选择的分化培养基上，于1500lux12-16h/d光照条件下培养以诱导产生转化的胚状体，其间每两周在相同培养基中继代一次，长出的胚状体又转入抗性分化培养基上于1500lux12-16h/d光照条件下培养以诱导产生抗性小植株。产生的抗性小植株再转接到抗性生根培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导生根并形成转化植株，获得的抗性植株再经过分子检测筛选出转基因植株。所述分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有KT、蔗糖、PPT、羧苄青霉素；所述抗性分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有BA、KT、蔗糖、PPT、羧苄青霉素；所述MR培养基是以1/5MS大量元素和MS其他成分为基础培养基，并添加有2，4-D、果糖、葡萄糖、蔗糖；所述抗性生根培养基是以MS为基础培养基，并添加有IAA、蔗糖、PPT、头孢霉素。抗逆材料的鉴定和筛选的过程把获得的转基因植株及相应的对照盆栽成活后分别在植物生长人工气候箱、大棚温室和大田进行逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆的生理生化指标(如海藻糖含量、离体叶片保水率、质膜透性、丙二醛含量、光和效率等)的测定，初步筛选出抗逆的转基因植株；对初选的抗逆转基因植株的无性繁殖后代继续进行植物生长人工气候箱、大棚温室和大田逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，测定抗逆的生理生化指标(同上)再结合其性状的重组分离情况，采用Southern杂交、PCR扩增、Bialaphos或PPT抗性表现等鉴定转基因后代的遗传稳定性，进一步选出抗逆的转基因株系；对优选转基因株系进行干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆的生理生化指标的测定，并在田间进行工农艺性状鉴定，最终评价转基因植株及其后代的抗逆性，筛选出抗逆的转基因甘蔗新种质。本专利技术所提供的培育甘蔗抗逆新种质材料的方法是利用植物基因工程技术把担子菌灰树花的海藻糖合酶基因通过农杆菌介导法转入甘蔗的胚性细胞中，再通过胚状体成苗途径培育出完整的植株(转基因植株)，使转基因植物具有抵抗逆境的能力，并最终提高甘蔗的产量和含糖量。它具有培育周期短、效率高、成本低、不受外界条件影响等优点。具体实施例方式下面结合实例对本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法，它包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、灰树花海藻糖合酶基因植物表达载体的构建及转化农杆菌过程、农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程、抗逆材料的鉴定和筛选过程，其特征在于：　 　（１）所述甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程是以优良甘蔗栽培种的幼嫩叶片基部为外植体，外植体先用７５％乙醇进行表面消毒后再用氯化汞溶液进行消毒，之后用无菌水进行冲洗并用无菌滤纸吸干其表面水分，然后将其切成薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，于２２－２８℃避光条件下进行培养，以诱导胚性愈伤组织的产生；所述诱导培养基是以ＭＳ为基础培养基，并添加有２，４－Ｄ０．８－１．２ｍｇ／Ｌ、蔗糖２５－３５ｇ／Ｌ，其ＰＨ在５．５－６．０之间；（２）所述灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载 体的构建和转化农杆菌的过程是从担子菌灰树花（Ｇｒｉｆｏｌａｆｒｏｎｄｏｓａ）的菌丝体中提取总ＲＮＡ，并纯化出ｍＲＮＡ，再以ｍＲＮＡ为模板经反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增灰树花的海藻糖合酶基因的ｃＤＮＡ并进行测序，所得的片段即为灰树花的 海藻糖合酶基因，之后把灰树花的海藻糖合酶基因（ＴＳａｓｅｇｅｎｅ）取代植物表达载体ｐＢＢＢ－ＥＴＲ中的ＥＴＲ基因，得到灰树花海藻糖合酶基因的植物表达载体ｐＢＢＢＴ，该基因由串联的双拷贝ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和逆境诱导表达启动子Ｐｒｄ２９Ａ 驱动，最后采用三亲交配法将其导入农杆菌ＥＨＡ１０５中；（３）所述农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育是取含有灰树花海藻糖合酶基因的农杆菌ＥＨＡ１０５单菌落接种到ＹＥＰ液体培养基中，于２５－２８℃，２００ ｒｐｍ振荡培养至ＯＤ↓［６００］为０．６－１．０后，离心回收细菌体，再重悬于等体积含１００－３００μｍｏｌ／ＬＡＳ的ＭＲ液体培养基中继续震荡培养１．５－２．５ｈ，以诱导细菌ｖｉｒ基因表达，此菌液即为转化用工程菌液，之后把胚性愈伤组织 转入处理好的农杆菌菌液中，侵染２５－３５ｍｉｎ后又用无菌吸水纸吸干菌液，再把胚性愈伤组织接种于ＭＲ固体培养基上于１８－２２℃黑暗条件下共培养４－６天，其后将胚性愈伤组织用无菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干水份后接种于含抗性选择的分化培养基上，于１５００ｌｕｘ１２－１６ｈ／ｄ光照条件下培养以诱导产生转化的胚状体，其间每１０－１５天在相同培养基中继代一次，长出的胚状体又转入...

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法，它包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、灰树花海藻糖合酶基因植物表达载体的构建及转化农杆菌过程、农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程、抗逆材料的鉴定和筛选过程，其特征在于(1)所述甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程是以优良甘蔗栽培种的幼嫩叶片基部为外植体，外植体先用75％乙醇进行表面消毒后再用氯化汞溶液进行消毒，之后用无菌水进行冲洗并用无菌滤纸吸干其表面水分，然后将其切成薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，于22-28℃避光条件下进行培养，以诱导胚性愈伤组织的产生；所述诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加有2，4-D0.8-1.2mg/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.5-6.0之间；(2)所述灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌的过程是从担子菌灰树花(Grifola frondosa)的菌丝体中提取总RNA，并纯化出mRNA，再以mRNA为模板经反转录PCR(RT-PCR)扩增灰树花的海藻糖合酶基因的cDNA并进行测序，所得的片段即为灰树花的海藻糖合酶基因，之后把灰树花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表达载体pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰树花海藻糖合酶基因的植物表达载体pBBBT，该基因由串联的双拷贝CaMV35S启动子和逆境诱导表达启动子Prd29A驱动，最后采用三亲交配法将其导入农杆菌EHA105中；(3)所述农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育是取含有灰树花海藻糖合酶基因的农杆菌EHA105单菌落接种到YEP液体培养基中，于25-28℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6-1.0后，离心回收细菌体，再重悬于等体积含100-300μmol/L AS的MR液体培养基中继续震荡培养1.5-2.5h，以诱导细菌vir基因表达，此菌液即为转化用工程菌液，之后把胚性愈伤组织转入处理好的农杆菌菌液中，侵染25-35min后又用无菌吸水纸吸干菌液，再把胚性愈伤组织接种于MR固体培养基上于18-22℃黑暗条件下共培养4-6天，其后将胚性愈伤组织用无菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干水份后接种于含抗性选择的分化...

【专利技术属性】
技术研发人员：张树珍，杨本鹏，冯翠莲，曾艳波，罗敬萍，蔡文伟，杨学，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]