生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器——人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法技术

本发明专利技术涉及生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器－人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下：（１）构建含有人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体，（２）构建双标记选择载体和单标记选择载体，通过电击方法进行细胞转染，获得转基因细胞，（３）转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转基因克隆动物。利用体细胞克隆技术生产转人溶菌酶基因的转基因牛，从而通过高产奶牛的乳腺大量生产具有活性的人溶菌酶。本发明专利技术所研究的重组人溶菌酶，具有与天然人溶菌酶相同的生物活性，既可开发出具有高附加值的保健牛奶，也可纯化出人溶菌酶并开发成药品和保健品。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及转基因—克隆

技术介绍
转基因动物研究是人类按着自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，而改变其遗传组成的目的是多种多样的。比如遗传学家希望通过改变动物的遗传组成来观察其表型变化，生理学家希望通过特定基因的表达来研究该基因对机体生理状况的影响。与动物生产有关的转基因研究则希望通过转基因技术来赋予动物新的表型性状。该项研究在实验技术上依赖分子生物学、动物胚胎和配子操作技术。转基因动物的制作方法目前主要有原核期胚胎的显微注射，逆转录病毒感染发育早期的动物胚胎，精子载体法，ES细胞技术，PGCs技术，体细胞核移植技术，逆转录病毒载体感染MII期的卵母细胞，精子头与DNA合并注射卵母细胞法。这些方法上的改进与提高大大地促进了转基因动物研究由实验室向生产实践转化的进程。其中最传统和最常用的方法是原核期胚胎的显微注射，该方法由美国人Gordon专利技术，是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。即在显微操作仪下通过一毛细玻璃管将外源DNA注射进动物受精卵细胞的原核内，再将该受精卵细胞移植进受体细胞子宫内，在受精卵分裂时，外源DNA可能整合入宿主染色体组，待该受精卵发育成熟即可获得转基因动物。但是显微注射法获得的转基因家畜的效率极低，特别是牛，羊和猪等，往往低于1％，这将大大增加制作转基因家畜的成本。随着体细胞克隆技术的发展，基因操作技术与克隆技术相结合是将成为转基因动物，特别是大家畜生产的主要方式。目前，取得的主要进展是转基因技术和靶位操作技术在克隆动物上的应用。首先，利用克隆进行转基因是指在核移植前，先把目的基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞，再通过标记基因的表现来筛选转基因的阳性细胞及其克隆，然后再移植。1997年，英国PPL公司的科学家Schnieke与罗斯林研究所的Wilmut等联手通过体细胞核移植技术率先在世界上制作了转基因绵羊。利用胎儿成纤维细胞系，经过转染之后，再克隆。利用克隆进行转基因，一旦核移植成功，从理论上讲，转基因成功率为100％。原核注射的方法会使大量的非转基因胚胎被怀孕，这是一种资源浪费，而利用克隆进行转基因技术不会造成代理母亲去怀孕非转基因动物。此外，利用克隆进行转基因时，转基因动物的性别会被提前决定。这样的话，如果想得到能在乳腺中表达蛋白质，就可以使克隆的转基因动物全是雌性动物。由于动物转基因技术能按照人们的意愿改变动物的生产性状，得到人们所需要的产品，特别是一些蛋白药品及保健品，科学家们已经开始将动物转基因技术应用到实践当中，目前动物转基因技术主要有以下一些应用(1)、促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质，(2)、动物抗病育种，(3)建立诊断和治疗人类疾病的动物模型，(4)生产药用蛋白。动物乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。通过基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我们进一步研究乳腺癌的机制，提高乳汁的营养成分，甚至可以合成药物。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的一百倍，是一种非常有潜力的高新技术。1987年，Simons等人在转基因小鼠乳腺中首次成功地表达羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶样中的蛋白含量高达23克/升，大约是动物细胞表达蛋白的400倍以上。该技术一经出现就得到迅猛的发展。目前，牛乳白蛋白基因人组织血纤维蛋白溶酶原因子，人生长激素基因，人体抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干扰素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表达。许许多多的著名科学家都认为这将是畜牧业前所未有的革命，可能会给社会带来巨大的经济效益。乳腺生物反应器生产药物的优越性让药物蛋白基因表达在某一特定部位，而不是随机地在身体任意表达。科学家们一致认为，就药物而言，理想的表达场所是乳腺。主要有以下原因1、动物乳腺是一个封闭的系统。乳腺组织表达的蛋白质绝大部分不会回到血液循环，这样就避免大量表达的外源性蛋白质对动物健康造成的危害。2、乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白250～300kg，一只绵羊和山羊可生产乳蛋白25～30kg，即使一只家兔，一年生产乳蛋白也可达到3～5kg，如果把百分之一的乳蛋白合成医用蛋白，其产量就十分可观。3、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，产品的生物学活性接近天然产品。4、在动物乳腺表达的外源基因可以遗传。一旦获得一个生产某种有价值蛋白质的动物个体，可以用常规畜牧技术繁殖生产群体，研究技术虽然复杂，费用高昂，但其研究生产的放大过程却较容易5、缩短新药上市周期。从药物生产开发周期方面来看，目前一种新药从它的研制开发、药审，直到上市，整个过程需要10～15年，如果利用转基因动物乳腺反应器，新药生产的周期约5年。6、可以获取巨额经济利润。如荷兰金发马公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从乳汁中提炼出来营养奶粉销售额是50亿美元。利用乳腺生物反应器的方法改造奶牛、奶山羊，使生产出的奶成分近似于人奶，既有营养的功能，又有药用的功能，这种奶可以使孩子长得高大，促进大脑和神经发育，增强免疫功能，这种新型保健品一定会有广阔的前途。改善奶的营养成份或生理生化特征也是人们希望通过改变动物的遗传组成来实现的目标之一，即制造所谓的营养药品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工产品可提供人类30％的营养蛋白，含有丰富的必需氨基酸、钙和无机磷酸盐，以及消化率很高的酪蛋白，是人类高质量的营养来源但家畜奶在品质上还是不尽如人意。因此，人们一直在研究如何改善奶品质。自Gordon创立动物转基因技术以来，世界各国都争先开展转基因育种及其相关技术研究。研究表明外源基因不仅能在转基因动物中得到整合与表达，而且能获得组织特异性(乳腺组织、输卵管)和发育特异性表达，并且现在能够利用分子技术找到调节乳成分的所有基因。牛乳的蛋白含量比人乳的高，牛乳为33g/L，而人乳仅为10g/L。其中最重要的是人乳中乳清蛋白含量(68％)比酪蛋白(32％)比例高，具有免疫活性的乳铁蛋白(15％)和溶菌酶(4％)含量高，且缺乏β-乳球蛋白和κ-酪蛋白。溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)，是天然非特异性免疫物质，具有强力杀菌作用。1922年，英国细菌科学家Fleming首次发现人的唾液和眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。此后在人和动物多种组织、分泌物，某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。溶菌酶可分为三型c型(鸡卵清溶菌酶，Chicken white lysozyme，cly)、g型(鹅卵清溶菌酶，googse egg-white lysozyme，gly)、噬菌体溶菌酶(Canfield and Mcmurry，1967)。大部分溶菌酶都属于c型，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属于c型。人溶菌酶(hLY)属于c型溶菌酶(Isabelle，1990)，具有抗菌、免疫调节及一定的抗肿瘤作用，有潜在的临床应用价值。人溶菌酶是一种由18种130个氨基酸组成的碱性多肽，分子量为14.7KD，等电点为pH11。其前体包含148氨基酸，其中前18个氨基酸为信号肽(N本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器－人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下：（１）构建含有人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体，（２）构建双标记选择载体和单标记选择载体，通过电击方法进行细胞转染，获得转基因细胞，（３）转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转基因克隆动物。

【技术特征摘要】
1.生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器——人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下(1)构建含有人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体，(2)构建双标记选择载体和单标记选择载体，通过电击方法进行细胞转染，获得转基因细胞，(3)转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转基因克隆动物。2.根据权利要求1所述的生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器——人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法，所述人溶菌酶基因含有人溶菌酶基因信号肽序列，1-4外显子，1-3内含子。3.根据权利要求1所述的生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器——人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法，所述人溶菌酶基因的特异表达载体是pBC1-HLY或pBC2-HLY。4.根据权利要求1所述的生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器——人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法，所述人溶菌酶基因还含有牛beta-casein信号肽序列，1-4外显子，1-3内含子。5.根据权利要求4所述的生产重组人溶菌酶的动...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤波，戴蕴平，龚国春，于政权，张磊，李宁，
申请(专利权)人：李宁，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]