枸杞ERF转录因子及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种枸杞ERF转录因子及其在调控枸杞类胡萝卜素生物合成中应用。本发明专利技术首次从枸杞中鉴定到一种关键LbERF5.1转录因子，并综合应用同源克隆、枸杞瞬时转化、酵母单杂、双荧光素酶检测等技术，解析了LbERF5.1转录因子通过与LbCCD4.1基因启动子上GCC

【技术实现步骤摘要】
枸杞ERF转录因子及其应用

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[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种枸杞ERF转录因子及其在调控枸杞类胡萝卜素生物合成中应用。

技术介绍
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[0002]类胡萝卜素是一种重要的天然色素，使植物果实、花朵呈现出华丽的颜色，如黄色、橙色和红色；同时，也是人类获得的维生素A的主要来源，还具有抗氧化、免疫调节和抗衰老的作用。目前，植物类胡萝卜素生物合成研究取得了重大进展，其生物合成途径已经非常清楚，并在大多植物中成功分离鉴定出了胡萝卜素生物合成的催化的酶基因。但在类胡萝卜素生物合成的转录调控方面，主要集中在MYB、MADS和NAC等类转录因子上，而大多数ERF类转录因子是主要调控植物生长发育过程中乙烯合成途径提高植物抗逆性。现有未见ERF转录因子在调控枸杞类胡萝卜素生物合成的相关报道。
[0003]宁夏枸杞是我国名贵中草药，其果实中富含多糖、类胡萝卜素、类黄酮、甜菜碱等生物活性物质。据报道，枸杞中含有叶黄素、α
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胡萝卜素、β
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胡萝卜素、β
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隐黄质、玉米黄素双棕榈酸酯等多种类胡萝卜素代谢物，其中，玉米黄素双棕榈酸酯，约占总类胡萝卜素含量的80％以上，类胡萝卜素是也其果实呈现出红色最重要的色素类物质，已成为医疗行业和工业生产该类物质的主要原料。同时，类胡萝卜素是植物体内重要的萜类化合物和风味前体物，对植物的生长发育、抗逆性密切相关。因此，为促进枸杞果实生长发育过程中类胡萝卜素积累及提高风味类物质含量，通过生物技术手段，寻找重要的转录因子调控类胡萝卜素生物合成是实现枸杞品质改良的有效技术手段。
[0004]已有研究表明，在植物中，类胡萝卜素裂解双加氧酶酶(CCD)是类胡萝卜素生物合成中关键降解酶。已发现了13个CCD家族成员，有多种CCD可以裂解类胡萝卜素中结合的碳碳双键，产生不同的类胡萝卜素，为萜类及风味类化合物提供重要的前体物。2021年枸杞基因组的公布，为解析枸杞类胡萝卜素生物合成机理提供了理论参考，但调控枸杞CCD的转录因子或互作蛋白尚不清楚，不能为枸杞萜类化合物开发和品质改善提供重要途径。

技术实现思路
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[0005]本专利技术首次从枸杞中鉴定到一种关键LbERF5.1转录因子，并发现其与LbCCD4.1基因启动子上GCC
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box位点结合，正向调控LbCCD4.1基因显著表达，进而应用于控制枸杞类胡萝卜素的生物合成，为实现枸杞品质改良提供有效技术手段。
[0006]本专利技术综合应用同源克隆、枸杞瞬时转化、酵母单杂、双荧光素酶检测等技术，解析了LbERF5.1转录因子及LbCCD4.1基因在类胡萝卜素生物合成中转录调控，为枸杞萜类及风味类化合物提供重要的前体物开发提供技术手段。
[0007]本专利技术提供的技术方案之一，是一种枸杞ERF转录因子，具体为LbERF5.1转录因子，所述LbERF5.1转录因子的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
[0008]本专利技术还提供LbERF5.1转录因子的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如序列
表SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术提到的技术方案之二，是包含上述LbERF5.1转录因子编码基因的重组载体、重组菌株；
[0010]进一步地，所述重组载体采用的表达载体包括但不限于pCambia1301
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35S、pCambia1300
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35s、pCambia3300
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35S等，优选地所述表达载体为pCambia1300
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35s质粒；
[0011]进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞包括但不限于农杆菌EHA105、农杆菌LBA4404、农杆菌GV3101等，优选地所述表达宿主为农杆菌GV3101；
[0012]优选地，所述重组菌株是将LbERF5.1转录因子与pCambia1300
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35s质粒构建重组载体后转化农杆菌GV3101所得。
[0013]本专利技术提供的技术方案之三，是上述LbERF5.1转录因子或其基因，或包含LbERF5.1转录因子基因的重组载体、重组菌株在调控枸杞中类胡萝卜素的生物合成中的应用；
[0014]进一步地，所述类胡萝卜素包括但不限于叶黄素、β
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胡萝卜素、叶黄素棕榈酸酯、叶黄素肉豆蔻酸酯、环氧玉米黄质、新叶黄素、玉米黄质、紫花素、紫花素棕榈酸酯、八氢番茄红素、β
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隐黄质、紫花素二丁酸酯、叶黄素癸酸酯、叶黄素二肉豆蔻酸酯、辣椒红素等；
[0015]进一步地，可通过在枸杞中过表达LbERF5.1转录因子负向调控类胡萝卜素代谢物的积累；
[0016]进一步地，可通过在枸杞中敲除或弱化LbERF5.1转录因子的表达正向调控类胡萝卜素代谢物的积累。
[0017]本专利技术提提供的技术方案之四，是一种调控枸杞中类胡萝卜素的生物合成的方法，所述方法是通过调控LbERF5.1转录因子与类胡萝卜素裂解双加氧酶LbCCD4.1基因启动子上GCC
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box位点的结合来实现；LbERF5.1转录因子可以与LbCCD4.1基因启动子上GCC
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box位点结合，从而正向调控LbCCD4.1基因的显著表达，LbCCD4.1基因的表达产物类胡萝卜素裂解双加氧酶进一步影响(分解)类胡萝卜素的积累；
[0018]进一步地，所述LbCCD4.1基因启动子为pro LbCCD4.1，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
[0019]进一步地，当pro LbCCD4.1上的GCC
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box位点发生突变时，使得LbERF5.1不能与该位点结合，从而导致LbCCD4.1基因表达的缺失，进而影响(促进了)类胡萝卜素的积累；
[0020]更进一步地，pro LbCCD4.1上的GCC
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box位点发生突变的基因为pro LbCCD4.1
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M，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；
[0021]更进一步地，通过对将枸杞中LbERF5.1转录因子进行过表达，促进其与LbCCD4.1基因启动子上GCC
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box位点结合，促进LbCCD4.1基因的显著表达，进而促进对类胡萝卜素的分解，减少类胡萝卜素的积累；
[0022]更进一步地，通过将枸杞中LbCCD4.1基因的启动子pro LbCCD4.1中的GCC
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box位点进行突变调控类胡萝卜素的积累，所述GCC
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box位点，分别位于ATG起始密码子上游
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133、
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186和
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347bp；
[0023]优选地，将pro LbCCD4.1突变为pro LbCCD4.1
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M来提高枸杞中类胡萝卜素的积累，所述pro LbCCD4.1
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M的核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枸杞ERF转录因子，其特征在于，具体为LbERF5.1转录因子，所述LbERF5.1转录因子的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述LbERF5.1转录因子的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。4.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用的表达载体包括但不限于pCambia1301
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35S、pCambia1300
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35s、pCambia3300
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35S。6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株采用的宿主细胞包括但不限于农杆菌EHA105、农杆菌LBA4404、农杆菌GV3101。7.权利要求1所述LbERF5.1转录因子、权利要求2所述编码基因、或权利要求4所述重组载体或重组菌株在调控枸杞中类胡萝卜素的生物合成中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，调控枸杞...

【专利技术属性】
技术研发人员：李浩霞，赵建华，安巍，尹跃，王亚军，梁晓捷，秦小雅，张曦燕，黄婷，张波，万如，罗青，段淋渊，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院林业与草地生态研究所宁夏防沙治沙与水土保持重点实验室，
类型：发明
国别省市：