一种用于检测癌症患者中肿瘤抗原的细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测癌症患者中肿瘤抗原的细胞系及其应用，所述细胞系其底盘细胞为TCRα链蛋白及TCRβ链蛋白敲除的Jurkat细胞，荷载有以8

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测癌症患者中肿瘤抗原的细胞系及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种用于检测癌症患者中肿瘤抗原的细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]TCR药物是肿瘤免疫治疗的重要方向，其在胰腺癌等免疫浸润水平低下的实体肿瘤中表现出了令人兴奋的治疗效果。T细胞受体T细胞(TCR
‑
T)疗法最初主要针对共同的肿瘤相关抗原肽靶点，随着最近的技术发展，靶向来自肿瘤体细胞突变的新抗原已成为可能，这代表了一种高度个性化的治疗。TCR
‑
T疗法已在世界各地的许多临床前研究和临床试验中被用于实体瘤的临床疗效测试。然而，TCR
‑
T治疗实体瘤的疗效依然面临许多挑战，包括低TCR亲和力、靶向毒性和导致肿瘤逃逸的靶抗原丢失。
[0003]肿瘤中特定抗原肽存在的数量对TCR药物的使用具有重要的指导作用。多项临床试验证明TCR药物发生耐药其主要原因为抗原递呈改变而非抗原丢失。一项针对如第12位甘氨酸突变为天冬氨酸的KRAS蛋白(KRAS
‑
G12D)突变胰腺癌的TCR
‑
T临床研究发现对药物耐药的转移灶中的肿瘤细胞发生了TCR
‑
T对应MHC分型基因的缺失；另一项针对NY
‑
ESO
‑
1过表达的滑膜肉瘤的临床研究则发现TCR
‑
T治疗后的患者肿瘤组织中的MHC表达量有了明显的下调。上述结果包含了抗原递呈途径造成肿瘤耐药包含两种可能性：一、抗原递呈途径相关蛋白发生突变导致其功能缺失；二、转录水平变化导致MHC表达量下调。抗原肽水平下调是上述变化的最终结果，但无法通过检测抗原蛋白表达水平变化进行检测。
[0004]遗憾的是，目前没有适用于临床快速检测抗原肽水平的方法。高分辨质谱检测要求的样本数量过多且存在较高的假阴性率，不适合临床场景的使用。若采用基因测序检测抗原递呈相关基因的突变情况，则目前尚未归纳出合适的生物标志物，没有一个适用的比较标准。所以当细胞表明表达TCR时，可以被靶抗原或者含有相应靶抗原的靶细胞激活，因此选用TCR敲除Jurkat细胞(简称J5细胞)作为细胞株进行后续基因编辑，构建成8
×
NFAT
‑
ZsG
‑
J5细胞株。因此，本专利技术提供了一种8
×
NFAT
‑
ZsG
‑
J5报告细胞系以及制备该细胞系的具体方法，对TCR
‑
T有效性功能评估具有重大意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于检测癌症患者中肿瘤抗原的细胞系，所述细胞系其底盘细胞为TCRα链蛋白及TCRβ链蛋白敲除的Jurkat细胞。荷载有以8
×
NFAT启动子或NR4A1启动子诱导表达的ZsGreen蛋白，其DNA序列见SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2及过表达有CD8蛋白，其DNA序列见SEQ ID NO.3，蛋白序列见SEQ ID NO.4。在此基础上过表达特异性TCR以检测对应抗原肽的含量。
[0006]本专利技术的细胞系通过以下方法获得：
[0007]1、敲除Jurkat细胞中的TCRα链蛋白以及TCRβ链蛋白采用CRISPR
‑
cas9技术先敲除TCRα链蛋白后再敲除TCRβ链蛋白。所用gRNA序列见
SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6。sgRNA递送：将1μg pX458
‑
TRAC与100μL，使用Lonza Nucleofector
TM
2b电转仪，按照电转程序X
‑
001将pX458
‑
TRAC质粒电转至5*10^5个Jurkat细胞中。电转后的细胞立即转移至预热的24孔板中培养基培养24h。流式分选GFP阳性细胞，按照每孔一个细胞，分选出单克隆细胞，并直接接种至96孔板中，培养10
‑
14天。
[0008]用流式细胞术检测单克隆，细胞转移至流式管中，加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。抗体孵育：取Biolegend公司货号为317318的APC anti
‑
human CD3 Antibody抗体，按照每管100μL，1:100比例配制抗体工作液，每管加入100μL，4℃孵育30min。之后加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。200μl PBS重悬细胞，流式上机检测，检测结果见图2。说明克隆#5
‑
4的TCRα被成功敲除。
[0009]同样的方法在#5
‑
4克隆中转染pX458
‑
TRBC质粒，并用相同的方法进行分选后，用流式细胞术检测单克隆的敲除情况。我们在敲除的克隆中感染了1G4
‑
α链通过检测CD3来检测是否TCRβ链被敲除。取10万形成单克隆后的细胞，采用慢病毒感染1G4α链，病毒感染换液后72h，收集细胞。细胞转移至流式管中，加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。抗体孵育：取Biolegend公司货号为317318的APC anti
‑
human CD3 Antibody抗体，按照每管100μL，1:100比例配制抗体工作液，每管加入100μL，4℃孵育30min。之后加入4mL PBS，450g离心5min，清洗一次。200μl PBS重悬细胞，流式上机检测，检测结果见图2。说明克隆#2
‑
10的TCRα和TCRβ被成功敲除。下文中该细胞称为TCR
‑
KO Jurkat。
[0010]2、在TCR
‑
KO Jurkat细胞中荷载8
×
NFAT
‑
ZsGreen报告基因及被检测抗原肽所对应的TCR
[0011]在TCRα链蛋白以及TCRβ链蛋白敲除的Jurkat细胞中采用慢病毒感染技术过表达8
×
NFAT启动子或NR4A1启动子诱导表达的ZsGreen蛋白及CD8蛋白。在上述细胞的基础上通过慢病毒感染过表达特定TCR获得能够检测该TCR对应抗原肽的检测细胞系。
[0012]本专利技术的另一个目的是提供所述细胞系在制备检测癌症患者中肿瘤抗原试剂中的应用，如NY
‑
ESO
‑
1蛋白及KRAS
‑
G12V蛋白所产生的肿瘤抗原。所述应用是利用Jurkat细胞中保有的TCR信号网络，利用TCR对对应抗原肽识别高灵敏性及高特异性的特性识别肿瘤细胞表面微量的抗原肽。更近一步的TCR信号的强度随着抗原肽水平的上调而增强，8
×
NFAT启动子及NR4A1启动子响应Jurkat细胞中的TCR信号网络中NFAT途径、NR4A1途径的激活强度，诱导下游荧光蛋白不同水平的表达。通过流式细胞术检测荧光蛋白表达水平的差异用于指本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测癌症患者中肿瘤抗原的细胞系，其特征在于，所述细胞系其底盘细胞为TCRα链蛋白及TCRβ链蛋白敲除的Jurkat细胞，荷载有以8
×
NFAT启动子或NR4A1启动子诱导表达的ZsGreen蛋白，其DNA序列见SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2。2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹戟，赵文彬，赵文艺，何俏军，洪成钢，鲁励，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：