食管癌转移及侵袭细胞模型及其应用制造技术

本发明专利技术公开了食管癌转移及侵袭细胞模型及其应用。对多株食管癌细胞系进行了体外筛选并分析研究了它们在体内的转移能力及侵袭能力，并且发现高转移和侵袭能力的食管癌细胞系中的miR150的表达往往低表达，这些食管癌细胞系能够作为正对食管癌细胞转移和侵袭药物体外筛选的模型细胞，大大提高了药物筛选的效率。率。率。

【技术实现步骤摘要】
食管癌转移及侵袭细胞模型及其应用


[0001]本专利技术涉及食管癌转移及侵袭
，具体涉及食管癌转移及侵袭细胞模型及其应用。

技术介绍

[0002]食管癌(esophagealcancer,EC)是常见上消化道癌症之一，预后差、死亡率高。根据组织病理学分类，食管癌可分为鳞状细胞癌、腺癌和腺鳞癌，其中食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)占食管癌90％以上。尽管目前在食管癌的诊断和治疗方面取得了很大进展，但食管癌患者的预后仍然很差。食管癌细胞转移是一个多步骤的复杂过程，肿瘤细胞的生长、侵袭、抗凋亡等能力都与肿瘤细胞发生远端转移的能力密切相关。为充分研究食管癌细胞转移，尤其是肺转移的相关机制和探索针对其转移的靶向药物，需要先在体外构建与食管癌细胞转移盒侵袭相关的模型细胞，以为药物筛选和提高其筛选效率提供帮助。

技术实现思路

[0003]为此，本专利技术对多株食管癌细胞系进行了体外筛选并分析研究了它们在体内的转移能力及侵袭能力，并且发现高转移和侵袭能力的食管癌细胞系中的miR150的表达往往低表达，这些食管癌细胞系能够作为正对食管癌细胞转移和侵袭药物体外筛选的模型细胞，大大提高了药物筛选的效率。本专利技术还发现了miR150可以与食管癌细胞转移侵袭能力相关的分子标记物，并且通过过表达miR150的干预，还能抑制食管癌细胞的转移和侵袭，为其药物干预提供另一种治疗前景。为此，本专利技术实施例至少公共了以下技术方案：
[0004]第一方面，本专利技术实施例公开了一种强转移侵袭能力的食管癌模型细胞系，所述食管癌模型细胞系miR150敲低的EC
‑
109
‑
1细胞、miR150敲低的EC
‑
109
‑
2细胞或miR150敲低的EC
‑
109细胞中的一种。
[0005]第二方面，一种强侵袭能力的食管癌模型细胞系的构建方法，所述构建方法包括：
[0006]将分离自EC
‑
109细胞食管癌裸鼠成瘤的原位肺转移灶组织细胞EC
‑
109
‑
1置于Transwell六孔板中；
[0007]将纤维环细胞置于Transwell小室中，于37℃、5％CO2共培养3周，每3d换液1次。
[0008]第三方面，一种食管癌模型细胞系miR150敲低的试剂盒，所述试剂盒包括携带miR150敲低序列的慢病毒载体以及用于转染细胞的试剂，其中所述miR150敲低序列包括一对大部分互补寡核苷酸片段，该寡核苷酸片段正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示。
[0009]进一步地，所述携带miR150敲低序列的慢病毒载体的表达框包括CMVPromoter、EmGFP报告基因、5
′
miRNAflankingregion、插入的敲减序列、3
′
miRNAflankingregion和转录终止序列。
[0010]第四方面，一种食管癌模型细胞系miR150敲低的试剂盒的制备方法，所述制备方
法包括携带miR150敲低序列的慢病毒载体的制备以及用于转染细胞试剂的配备；其中所述携带miR150敲低序列的慢病毒载体的制备方法包括：
[0011]获得miR150敲低序列，所述miR150敲低序列包括正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示；
[0012]将所述miR150敲低序列连接至pcDNA6.2
‑
GW/EmGFP
‑
miR载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，测序和鉴定，得到质粒pGW
‑
miR150；
[0013]将pGW
‑
miR150经ClaⅠ/SalⅠ双酶切回收的小片段与
[0014]pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
copGFP经ClaⅠ/SalⅠ双酶切回收的大片段于16℃用T4连接酶连接过夜，转化Stabl3感受态细胞，挑选阳性克隆，测序和鉴定，得到携带miR150敲低序列的慢病毒载体。
[0015]第五方面，一种弱侵袭能力的食管癌模型细胞系，所述食管癌模型细胞系为miR150过表达的EC
‑
109
‑
1细胞和/或miR150过表达的EC
‑
109
‑
2细胞。
[0016]第六方面，一种食管癌模型细胞系miR150过表达的试剂盒，所述试剂盒包括miR150过表达载体以及用于转染细胞的试剂，其中，所述miR150过表达载体包括miR150的前体序列，所述前体序列如SEQ ID NO.6所示。
[0017]第七方面，一种抑制食管癌细胞转移盒侵袭的试剂或药物，所述试剂或药物包含miR150过表达载体，所述所述miR150过表达载体包括miR150的前体序列，所述前体序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018]第八方面，一种食管癌细胞转移及侵袭关联的标志物，所述标志物为miR150，所述miR150的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0019]第九方面，用于检测食管上皮细胞和或食管肿瘤细胞转移能力的试剂盒，所述试剂盒包括miRNA提取试剂、PCR反应试剂以及PCR产物电泳试剂，其中，所述miR150过表达载体包括miR150的前体序列，所述前体序列如SEQ ID NO.6所示。
[0020]与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果之一：
[0021]本专利技术通过将人食管癌细胞EC
‑
109移植制作了食管癌荷瘤小鼠，并从其肺转移灶中分离了一种具有强转移和侵袭能力的细胞株EC
‑
109
‑
1，并进一步通过对其培养建立了更加具有转移和侵袭能力的细胞系EC
‑
109
‑
2，通过对EC
‑
109细胞、EC
‑
109
‑
1细胞和EC
‑
109
‑
2细胞的miRNA分析发现了，其中miRNA的表达存在显著差异。
[0022]由此进一步地，本专利技术通过将这些细胞系中的miRNA进行过表达或者敲低，证明了miR150可以抑制食管癌的转移和清晰，并且通过双荧光素酶报告验证了miR150对CYR61的靶向作用。
[0023]在此过程中，本专利技术公开了与转移性食管癌细胞的模型细胞系，通过，这些模型细胞系可以应用于针对食管癌细胞转移的药物筛选，例如将过表达miR150的生物相容性的靶向寡合苷酸或者载体作为药物，或者筛选有促进miR150表达的药物提供了模型细胞。
附图说明
[0024]图1是食管癌荷瘤小鼠肿瘤组织(上图)和HE染色(下图)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种强转移侵袭能力的食管癌模型细胞系，其特征在于，所述食管癌模型细胞系为miR150敲低的EC
‑
109
‑
1细胞、miR150敲低的EC
‑
109
‑
2细胞或miR150敲低的EC
‑
109细胞中的一种。2.一种强侵袭能力的食管癌模型细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将分离自EC
‑
109细胞食管癌裸鼠成瘤的原位肺转移灶组织细胞EC
‑
109
‑
1置于Transwell六孔板中；将纤维环细胞置于Transwell小室中，于37℃、5％CO2共培养3周，每3d换液1次。3.用于敲低食管癌模型细胞系miR150的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括携带miR150敲低序列的慢病毒载体以及用于转染细胞的试剂，其中所述miR150敲低序列包括一对大部分互补寡核苷酸片段，该寡核苷酸片段正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述携带miR150敲低序列的慢病毒载体的表达框包括CMVPromoter、EmGFP报告基因、5
′
miRNAflankingregion、插入的敲减序列、3
′
miRNAflankingregion和转录终止序列。5.一种食管癌模型细胞系miR150敲低的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括携带miR150敲低序列的慢病毒载体的制备以及用于转染细胞试剂的配备；其中所述携带miR150敲低序列的慢病毒载体的制备方法包括：获得miR150敲低序列，所述miR150敲低序列包括正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示；将所述miR150敲低序列连接至pcDNA6.2
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【专利技术属性】
技术研发人员：松本晴男，
申请(专利权)人：上海圣石生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：