半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体及其制备方法和应用，属于生物技术中鱼类性腺调控技术领域，所述半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体为携带miR

【技术实现步骤摘要】
半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术中鱼类性腺调控
，具体地涉及一种半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]脊椎动物的性别决定机制一直是备受关注的基础生物学问题，一般可以分为两种方式：遗传性别决定(Genetic sex determination，GSD)和环境性别决定(Environmental sex determination，ESD)。大多数动物的性别决定方式是GSD，即个体最终的性别由遗传物质决定，所有的哺乳动物、鸟类和两栖类动物，绝大部分的昆虫，一部分的爬行动物和鱼类采用这种方式；另外一部分动物的性别由温度、pH、光周期和社会关系等环境因素决定，与遗传物质无关，即ESD类型，这种情况主要发生在许多爬行动物和一部分鱼类中。此外，有的动物即使是GSD类型，其性别分化过程也会受到诸如温度等外界环境影响，目前，这种现象在欧洲鲈鱼、罗非鱼、河豚、黄颡鱼、蓝鳃太阳鱼等多种我国重要经济鱼类中均有报道。以温度为例，高温环境下，遗传雌鱼会发生性逆转，性腺发育为精巢，成为表型是雄鱼但基因型仍为雌鱼的个体—伪雄鱼，尤为有趣的是伪雄鱼的后代几乎全部自发性逆转变为伪雄鱼，导致养殖过程中雌鱼比例逐渐降低。由于伪雄鱼生长速度和正常雄鱼类似，仅为雌鱼的四分之一，导致了养殖产量下降，严重影响了此类鱼类产业的规模化发展。因此，探寻性逆转的有效方法，可为突破雌鱼比例过低的产业瓶颈提供技术支撑，为养殖鱼类性别控制育种提供理论依据，对培育具有优良性状的单性养殖鱼类新品种具重要作用。
[0003]MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，一般对于基因表达具有负调控作用。动植物细胞核基因组的编码区和非编码区均可表达miRNA，成熟的miRNA在细胞质中可与Argonaute蛋白结合为RNA诱导沉默复合物(RISC)，进而与目标基因mRNA的3
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非编码区(UTR)结合。如果互补配对完全，则导致目标mRNA被RNA外切酶降解，如果互补配对不完全，则阻碍核糖体与目标mRNA的结合，抑制蛋白质翻译。miRNA在物种间具有高度保守性，对生物基础功能调节具有重要作用，目前研究发现许多miRNA参与到哺乳动物的性别决定和性腺发育成熟过程中，例如miR
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124能够调节雄性性别决定基因sox9，而miR
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202和miR
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140则在精巢发育过程中起重要作用。目前，鱼类中的相关研究尚未深入，前期研究发现miR
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124a可调控半滑舌鳎性别决定关键dmrt1。
[0004]miRNA不仅存在于细胞内部，也广泛存在于动物体液中，例如：血液、乳汁、精液、脑脊液、腹腔液等。由细胞主动释放的miRNA，可以通过体液运输到达受体细胞调控基因表达，起到细胞间信息传递的作用。而外泌体正是体液中递送miRNA的重要方式，其特有的膜结构在运输过程中可以起到保护和受体识别的作用。外泌体(exsomo)是细胞分泌的一种胞外小泡，具直径为30
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150nm的膜结构，由天然的蛋白质和脂质组成，在体内可以由多种类型的细胞分泌，并可以通过体液等方式的运输，到达靶细胞区域，从而影响靶细胞的生存、信号传递、增殖和凋亡等多种生理活动。由于外泌体本身的很多特点，目前已经尝试被运用到疾病的诊断和治疗中，但尚未有关于工程化外泌体并靶向调控鱼类性别相关的技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种于克服现有技术的不足，提供工程化的半滑舌鳎性腺细胞外泌体、及其制备方法和在性别调控中的应用，提供一种携带miR
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124a的半滑舌鳎性腺细胞外泌体，并对该外泌体进行膜修饰，构建一种外泌体的递送系统，可靶向作用于半滑舌鳎精巢以精确调节性别决定基因dmrt1，用于调控鱼类性别。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现：
[0007]一种半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体，所述工程化外泌体为携带miR
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124a的半滑舌鳎性腺细胞外泌体，所述外泌体的膜有异硫氰酸荧光素(FITC)标记多肽靶向修饰，所述的多肽为PEP1。
[0008]所述PEP1的氨基酸序列为FMTDHSYQGNRQQQKTCN。
[0009]本专利技术还提供一种半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体的制备方法，所述方法为培养半滑舌鳎性腺细胞，选取半滑舌鳎性腺间充质组织，洗涤去除杂质，将其切割成碎块，将所述碎块洗涤干净后置于离心管中，离心收集沉淀；将所述沉淀进行消化处理后加入原代培养液进行洗涤，其后离心收集沉淀并均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入培养液，置于细胞培养箱中培养，每三天更换一次培养基，直至细胞单层形成；将所述原代卵巢细胞在传代培养基上进行传代培养；培育的性腺细胞后分离外泌体，将分离的外泌体与Exo
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Fect
TM
和miRNA模拟物孵育后，将miR
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124a转染至外泌体；其后，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记多肽对外泌体膜进行靶向修饰，获取膜修饰的工程化外泌体。
[0010]所述方法具体如下：
[0011]第一步、选取生长周期为4
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7月龄的半滑舌鳎，取其性腺组织，洗涤去除杂质，将其切割成碎块，将所述碎块洗涤干净后置于离心管中，离心收集沉淀A；
[0012]第二步、将所述沉淀A进行消化处理，向所述沉淀A中加入消化液，振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，离心，弃上清；向沉淀中加入培养基进行洗涤，离心收集沉淀B；
[0013]第三步、将所述沉淀B涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入培养基，置于细胞培养箱中培养，每三天更换一次培养基，直至细胞单层形成，细胞以1:2的分流比达到约90％(4.5
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106)时，将细胞消化并转移到新的烧瓶中，传代至第五代时进行相关基因检测；
[0014]第四步、将第三步培育的性腺细胞置于离心管中，在4℃下，经过300g离心10min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000g下离心10min
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20min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、10000g下离心10min
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20min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000g下超速离心70
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120min；收集沉淀，经过无菌PBS重悬，在经过无菌滤膜过滤后，得到外泌体进行低温保存；
[0015]第五步、将分离的外泌体与Exo
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Fect
TM
和miRNA模拟物在37℃下孵育10
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20分钟，置于冰上30
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60分钟后，用PBS洗涤和再浓缩，得到转染了miR
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124a的外泌体；
[0016]第六步、用二油酰磷脂酰乙醇胺
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N
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羟基琥珀酰亚胺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体为携带miR
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124a的半滑舌鳎性腺细胞外泌体，所述外泌体的膜有异硫氰酸荧光素标记多肽靶向修饰，所述的多肽为PEP1，所述PEP1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。2.权利要求1所述半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法为培养半滑舌鳎性腺细胞，选取半滑舌鳎性腺间充质组织，洗涤去除杂质，将其切割成碎块，将所述碎块洗涤干净后置于离心管中，离心收集沉淀；将所述沉淀进行消化处理后加入原代培养液进行洗涤，其后离心收集沉淀并均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入培养液，置于细胞培养箱中培养，每三天更换一次培养基，直至细胞单层形成；将所述原代卵巢细胞在传代培养基上进行传代培养；培育的性腺细胞后分离外泌体，将分离的外泌体与Exo
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Fect
TM
和miRNA模拟物孵育后，将miR
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124a转染至外泌体；其后，用异硫氰酸荧光素标记多肽对外泌体膜进行靶向修饰，获取膜修饰的工程化外泌体。3.权利要求1所述半滑舌鳎性腺细胞工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法具体如下：第一步、选取生长周期为4
‑
7月龄的半滑舌鳎，取其性腺组织，洗涤去除杂质，将其切割成碎块，将所述碎块洗涤干净后置于离心管中，离心收集沉淀A；第二步、将所述沉淀A进行消化处理，向所述沉淀A中加入消化液，振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，离心，弃上清；向沉淀中加入培养基进行洗涤，离心收集沉淀B；第三步、将所述沉淀B涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入培养基，置于细胞培养箱中培养，每三天更换一次培养基，直至细胞单层形成，细胞以1:2的分流比达到90％时，将细胞消化并转移到新的烧瓶中，传代至第五代时进行相关基因检测；第四步、将第三步培育的性腺细胞置于离心管中，在4℃下，经过300g离心10min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000g下...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵长伟，朱腾飞，王倩，王洪岩，马文秀，孙衍旭，李硕，岳博文，李玮静，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：