一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用技术

本发明专利技术属于传感器领域，涉及双参数检测模式的探索，特别是指一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用。本申请的用于双参数同时检测的荧光传感检测方法。在优化条件下，分别以(PTEN、AD、HBV、P53

【技术实现步骤摘要】
一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于传感器领域，涉及双参数检测模式的探索，特别是指一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，实现多参数同时检测的方法主要有有电化学法、比色法和荧光法。在电化学方法中，固定在电极表面的DNA探针会和待检测的物质相互作用，并诱导DNA结构和电化学性质发生变化，从而产生电信号来检测待测物。多参数检测时，传统方法是在核酸适体链上标记二茂铁或亚甲基蓝，通过氧化还原电位值的不同实现对不同目标物的检测，例如Zheng Y,Liang W,Yuan Y,et al.Wavelength
‑
resolved simultaneous photoelectrochemical bifunctional sensor on single interface:A newly in vitro approach for multiplexed DNA monitoring in cancer cells[J].Biosensors and Bioelectronics。电化学传感器虽具有灵敏度高、选择性好、检出限低等优点，但其电极制备过程繁琐；比色法通常是通过观测一些DNA过氧化物酶催化小分子产生的颜色变化或是不同分散状态下金属纳米棒的颜色差异来获得信号的。多参数检测时，加入不同待测物会产生不同颜色，通过颜色的变化来确定待测物类型。比色传感器构建成本较低、操作简单、实用性强，但在检测的精度方面有所欠缺，而患者在早期诊断时疾病标志物基因含量通常只有痕量；荧光法是依靠荧光信号为检测手段，常见荧光信号分子主要包括修饰在DNA分子上的荧光基团，金银铜纳米簇等。除此之外，G
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四链体还能与一些卟啉类的分子，如N
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甲基卟啉二丙酸IX、硫磺素T等特异性结合发出荧光。多参数检测时，通过在DNA链标记或特异性结合具有不同荧光发射的荧光染料实现检测。荧光传感器有稳定性好、灵敏度高、操作简单、使用寿命长等优点，在实际生活中应用广泛，具有广阔的应用前景。
[0003]为开发一种操作简单、普适性强、响应速度快的用于双参数同时检测的生物传感器方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术提出一种用于双参数检测的荧光传感器的构建方法及应用，用于荧光信号分子硫磺素T和FAM(6
‑
羧基荧光素)的发光特性，通过分子发夹构型变化，实现荧光转换，建立了用于两种疾病标志物基因同时检测的荧光传感器，并对其普适性做了相关研究。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，步骤为：
[0007](1)配制含有发夹探针HP1和发夹探针HP2的Tris
‑
HCl缓冲液，经避光静置激活，作为储备液；
[0008](2)向储备液中加入缓冲液，再加入ThT溶液，室温培养即得荧光传感器的工作溶液。
[0009]上述步骤(1)中发夹探针HP1为有标记荧光探针，发夹探针HP2为无标记荧光探针。
[0010]上述发夹探针HP1的3
’
端与
‑
BHQ1相连、5
’
端与FAM
‑
相连。
[0011]上述发夹探针HP1为HP(BRCA2)、HP(DNA19)、HP(K
‑
ras)、HP(P53
‑
1)和HP(DNA36)中的任意一个；其中HP(BRCA2)序列如SEQ ID No.2所示、HP(DNA19)序列如SEQ ID No.3所示、HP(K
‑
ras)序列如SEQ ID No.4所示、HP(P53
‑
1)序列如SEQ ID No.5所示、HP(DNA36)序列如SEQ ID No.6所示；发夹探针HP2为HP(AD)、HP(P53
‑
2)、HP(PTEN)和HP(HBV)中的任意一个；其中HP(AD)序列如SEQ ID No.1所示、HP(P53
‑
2)序列如SEQ ID No.7所示、HP(PTEN)序列如SEQ ID No.8所示、HP(HBV)序列如SEQ ID No.9所示。
[0012]上述Tris
‑
HCl缓冲液的浓度为20mmol/L、pH为7.0；储备液中发夹探针HP1和发夹探针HP2的浓度均为5μmol/L。
[0013]上述步骤(2)中缓冲液为20mM Tris
‑
HCl、300mM KCl，pH＝9；ThT溶液的浓度为2100μmol/L。
[0014]上述储备液、缓冲液与ThT溶液的体积比为1:46:0.5；室温培养的时间为5min。
[0015]上述的构建方法制备的荧光传感器。
[0016]上述的荧光传感器在非疾病诊断为目的的同时检测多种目标物中的应用，步骤为：向588μL荧光传感器的工作溶液中加入待测溶液，37℃恒温摇床孵育60min，利用荧光分光光度计检测加入待测溶液前后的荧光值F和F0，计算荧光强度的变化值F
‑
F0，代入线性方程计算目标物的浓度；其中荧光分光光度计的激发波长设置为460nm，发射波长为465～650nm，激发狭缝为2.5nm，发射狭缝为5.0nm。
[0017]上述目标物为AD和BRCA2时线性方程为y＝3.9897x
‑
6.5337，R
12
＝0.9886，y＝4.0938x+0.3458，R
22
＝0.9939，检出限分别为0.53和0.36nmol/L；目标物为AD和DNA19时线性方程为y＝3.3290x
‑
0.8471，R
12
＝0.9966，y＝4.3307x+2.8466，R
22
＝0.9914，检出限分别为0.67和0.34nmol/L；目标物为AD和K
‑
ras时线性方程为y＝3.0940x
‑
6.5998，R
12
＝0.9795，y＝4.1836x+12.1746，R
22
＝0.9744，检出限分别为0.72和0.31nmol/L；目标物为AD和P53
‑
1时线性方程为y＝3.1007x
‑
4.2411，R
12
＝0.9966，y＝4.4243x+0.1620，R
22
＝0.9996，检出限分别为0.81和0.37nmol/L；目标物为AD和DNA36时线性方程为y＝2.9428x
‑
3.7615，R
12
＝0.9981，y＝3.0487x+0.6233，R
22
＝0.9997，检出限分别为0.83和0.63nmol/L，目标物为P53
‑
2和P53
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，其特征在于，步骤为：（1）配制含有发夹探针HP1和发夹探针HP2的Tris
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HCl缓冲液，经避光静置激活，作为储备液；（2）向储备液中加入缓冲液，再加入ThT溶液，室温培养即得荧光传感器的工作溶液。2.根据权利要求1所述的用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中发夹探针HP1为有标记荧光探针，发夹探针HP2为无标记荧光探针。3.根据权利要求2所述的用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，其特征在于：所述发夹探针HP1的3
’
端与
‑
BHQ1相连、5
’
端与FAM
‑
相连。4. 根据权利要求2所述的用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，其特征在于：所述发夹探针HP1为HP(BRCA2)、HP(DNA19)、HP(K
‑
ras)、HP(P53
‑
1)和HP(DNA36)中的任意一个；其中HP(BRCA2)序列如SEQ ID No.2所示、HP(DNA19) 序列如SEQ ID No.3所示、HP(K
‑
ras) 序列如SEQ ID No.4所示、HP(P53
‑
1)序列如SEQ ID No.5所示、HP(DNA36)序列如SEQ ID No.6所示；发夹探针HP2为HP(AD)、HP(P53
‑
2)、HP(PTEN)和HP(HBV) 中的任意一个；其中HP(AD)序列如SEQ ID No.1所示、HP(P53
‑
2)序列如SEQ ID No.7所示、HP(PTEN)序列如SEQ ID No.8所示、HP(HBV)序列如SEQ ID No.9所示。5. 根据权利要求1
‑
4任一项所述的用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，其特征在于：所述Tris
‑
HCl缓冲液的浓度为20 mmol/L、pH为7.0；储备液中发夹探针HP1和发夹探针HP2的浓度均为5 μmol/L。6. 根据权利要求5所述的用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中缓冲液为20 mM Tris
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HCl、300 mM KCl，pH=9；ThT溶液的浓度为2100 μmol/L。7.根据权利要求5所述的用于双参数检测的荧光传感器的构建方法，其特征在于：所述储备液、缓冲液与ThT溶液的体积比为1:46:0.5；室温培养的时间为5min。8.权利要求1
‑
4、6
‑
7任一项所述的构建方法制备的荧光传感器。9. 权利要求8所述的荧光传感器在非疾病诊断为目的的同时检测多种目标物中的应用，其特征在于，步骤为：向588μL荧光传感器的工作溶液中加入待测溶液，37℃恒温摇床孵育60min，利用荧光分光光度计检测加入待测溶液前后的荧光值F和F...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜利英，任林娇，张培，秦自瑞，薛梦晓，魏铭航，孙建海，张庆芳，王杨，张吉涛，
申请(专利权)人：郑州轻工业大学，
类型：发明
国别省市：