一种肠道病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种肠道病毒载体及其应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供一种肠道病毒载体，肠道病毒载体以EV71复制子EV71replicon为骨架，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术提供一种可表达其他膜蛋白的或可表达分泌蛋白的肠道病毒载体，以及构建方法。本发明专利技术还提供了带有膜蛋白报告基因的CA16感染性克隆(CA16

【技术实现步骤摘要】
一种肠道病毒载体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种肠道病毒载体及其应用，属于生物医药


技术介绍

[0002]肠道病毒属(Enterovirus)属于小RNA病毒科的单股正链RNA病毒科，肠道病毒属包含15个种，分别为EnterovirusA
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I和RhinovirusA
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C，其中常见的肠道病毒有EnterovirusA71(EVA71)、CoxsackievirusA10(CVA10)、Human rhinovirusA1(HRVA1)、Poliovirus(PV)等。病毒基因组长度为7.5kb左右，由5
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端非编码区(5
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UTR)、编码区以及3
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端非编码区(3
’
UTR)组成。病毒感染细胞后，释放基因组RNA进入细胞质并进行复制和翻译。病毒基因组含有一个阅读框，首先在细胞质中翻译形成包括结构蛋白和非结构蛋白的多聚蛋白，随后病毒编码的蛋白酶2A和3C切割多聚蛋白，形成成熟的4种结构蛋白
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VP1、VP2、VP3和VP4以及7种非结构蛋白
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2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。肠道病毒基因组的复制过程发生在位于细胞质的复制复合物(Replicationorganelle,RO)中，成熟的复制相关蛋白进入RO辅助RNA的复制，另一方面结构蛋白包裹病毒RNA组成正二十面体的成熟的病毒颗粒并释放至胞外。
[0003]肠道病毒感染可引起系统性的黏膜免疫反应使其成为一种极具潜力的病毒载体。基于肠道病毒基因组的载体研究根据载体结构不同分为两大类：一类为以病毒基因组全长为载体，直接在病毒的阅读框中插入外源基因，这类载体可以自我复制，在表达外源蛋白的同时也会产生成熟的病毒颗粒；另一类为以复制子(Replicon，缺失部分或全部结构蛋白基因组的序列)为载体，将外源蛋白的序列置于病毒结构蛋白编码区，这类载体可以自我复制，但在表达外源蛋白时由于缺乏病毒结构蛋白而不会产生成熟的病毒颗粒。由于肠道病毒生活史完全在胞浆中完成，以肠道病毒基因组为基础的载体虽能表达外源性胞浆蛋白，但却难以表达携带信号肽的外源蛋白，如膜蛋白和分泌蛋白。例如，据文献报道，以PV replicon为载体无法直接表达流感病毒血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)，只有将载体设计为双顺反子时，才能成功表达HA蛋白。但研究也表明该类双顺反子肠道病毒基因组的稳定性差，传代几次就会完全丢失。因此，未经改进的肠道病毒载体难以表达主要为糖蛋白(带信号肽的膜蛋白或分泌蛋白)的各类免疫原，限制了肠道病毒载体的发展和应用。
[0004]Gluc荧光素酶是一种分离于大型海洋桡脚类动物的新型荧光素酶，Gluc催化底物腔肠素氧化反应的发光强度比萤火虫荧光素酶(Fluc)反应更强。与传统的Fluc不同，Gluc含有分泌型信号肽，属于天然的分泌蛋白，作为携带信号肽的外源蛋白报告基因特别适用于载体研究。
[0005]本专利技术以Gluc为报告基因，通过对外源蛋白的跨膜区序列进行优化，使肠道病毒载体顺利表达外源膜蛋白。进一步地，在跨膜区设计基础上，通过添加Furin识别和T2A切割位点，成功表达外源分泌蛋白。此外，本专利技术还首次成功制备了带有膜蛋白报告基因的CA16感染性克隆并拯救出CA16
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memHiBiT报告病毒。上述这些设计使得肠道病毒载体克服了自身的限制，得以表达任何亚细胞定位的外源蛋白，因此拓宽了肠道病毒载体的应用范围。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为解决如何使肠道病毒载体稳定表达携带信号肽的外源蛋白的技术问题。
[0007]本专利技术提供一种肠道病毒载体，所述肠道病毒载体以EV71复制子EV71replicon为骨架，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]本专利技术提供一种肠道病毒载体在制备疫苗和抗病毒药物上的应用。
[0009]本专利技术提供一种可表达其他膜蛋白的肠道病毒载体，所述肠道病毒载体至少包括如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的EV71复制子和跨膜区片段；所述跨膜区片段至少包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的PDGFRβTM、如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的SpikeTM、如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的CD28TM、如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的PDGFRβ+SpikeTM或如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的Linker+TM+Linker。
[0010]本专利技术提供一种可表达其他膜蛋白的肠道病毒载体在制备疫苗和抗病毒药物上的应用。
[0011]本专利技术提供一种可表达分泌蛋白的肠道病毒载体，所述肠道病毒载体包括上述的一种可表达其他膜蛋白的肠道病毒载体和切割位点片段；所述切割位点片段至少包括如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的Furin识别区、如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的mFurin识别区或如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的T2A。
[0012]本专利技术提供一种可表达分泌蛋白的肠道病毒载体在制备疫苗和抗病毒药物上的应用。
[0013]本专利技术提供一种携带膜展示型报告基因的CA16感染性克隆的构建方法，以pSVA
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CA16为模板，引入memHiBiT膜展示型报告基因，通过无缝重组克隆，得到测序正确的pSVA
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CA16
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memHiBiT感染性克隆；所述CA16
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memHiBiT的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述memHiBi膜展示型报告基因片段插入在5
’
UTR与P1片段之间。
[0014]本专利技术提供一种携带膜展示型报告基因的CA16感染性克隆在筛选抗病毒药物上的应用。
[0015]本专利技术提供一种可表达其他膜蛋白的肠道病毒载体的构建方法，以肠道病毒属中血清型病毒基因组为骨架构建的载体为模板，通过PCR扩增不同跨膜区片段，再通过无缝克隆，构建带有不同跨膜区片段的克隆，筛选经测序验证正确的克隆并提取质粒保存；所述跨膜区片段至少包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的PDGFRβTM、如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的SpikeTM、如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的CD28TM、如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的PDGFRβ+SpikeTM或如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的Linker+TM+Linker。
[0016]本专利技术提供一种可表达分泌蛋白的肠道病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
[0017]步骤1：以肠道病毒属中血清型病毒基因组为骨架构建的载体一为模板，通过PCR扩增不同跨膜区片段，再通过无缝克隆，构建带有不同跨膜区片段的载体二，筛选经测序验证正确的克隆并提取质粒保存；所述跨膜区片段至少包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的PDGFRβTM、如SEQ ID NO.4所示核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠道病毒载体，其特征在于，所述肠道病毒载体以EV71复制子EV71replicon为骨架，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的一种肠道病毒载体在制备疫苗和抗病毒药物上的应用。3.一种可表达其他膜蛋白的肠道病毒载体，其特征在于，所述肠道病毒载体至少包括如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的EV71复制子和跨膜区片段；所述跨膜区片段至少包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的PDGFRβTM、如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的Spike TM、如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的CD28 TM、如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的PDGFRβ+Spike TM或如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的Linker+TM+Linker。4.根据权利要求3所述的一种可表达其他膜蛋白的肠道病毒载体在制备疫苗和抗病毒药物上的应用。5.一种可表达分泌蛋白的肠道病毒载体，其特征在于，所述肠道病毒载体包括如权利要求3所述的肠道病毒载体和切割位点片段；所述切割位点片段至少包括如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的Furin识别区、如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的mFurin识别区或如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的T2A。6.根据权利要求5所述的一种可表达分泌蛋白的肠道病毒载体在制备疫苗和抗病毒药物上的应用。7.一种携带膜展示型报告基因的CA16感染性克隆的构建方法，其特征在于，以pSVA
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CA16为模板，引入memHiBiT膜展示型报告基因，通过无缝重组克隆，得到测序正确的pSVA
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CA16
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memHiBiT感染性克隆；所述CA16
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memHiBiT的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述memHiBi膜展示型报告基因片段插...

【专利技术属性】
技术研发人员：章树业，徐建青，张晓燕，喻锐，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：