一种过表达神经生长因子的AAV载体、重组病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种过表达神经生长因子(NGF)的AAV载体、重组病毒及其应用，属于基因药物技术领域。本发明专利技术提供了过表达神经生长因子的AAV载体以及含有该AAV载体的重组病毒，本发明专利技术所述AAV载体或重组病毒可用于制备治疗角膜神经损伤相关疾病产品。本发明专利技术还提供了含有所述AAV载体或重组病毒的注射剂，可通过一次角膜基质注射在靶细胞内持续表达神经生长因子并维持3月以上，弥补了传统神经生长因子滴眼液作用时间短、长期高频率给药、停药后疾病反复的缺陷，对患者依从性要求低，具有更广阔的应用前景。的应用前景。的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种过表达神经生长因子的AAV载体、重组病毒及其应用


[0001]本专利技术属于基因药物
，尤其涉及一种过表达神经生长因子的AAV载体、重组病毒及其应用。

技术介绍

[0002]角膜神经功能受损可导致神经营养性角膜炎(NK)，患病率约为每万人1.6～4.2例，可导致视力受损，甚至永久性失明。临床上NK按其严重程度分为3期：I期NK表现为眼表不规则角膜上皮荧光素点状染色；II期NK表现为持续性上皮缺损伴间质肿胀；III期NK表现为基质融解，可能导致穿孔。疱疹病毒感染、颅眼手术、眼表热和化学损伤是NK的常见原因，随着糖尿病周围神经病变研究的深入，糖尿病神经营养性角膜病变也成为NK的重要组成部分，其发病率每年增加。
[0003]目前NK的主要治疗方法是对症治疗。早期治疗包括支持性治疗，如人工泪液、绷带镜和及时泪道栓塞。进行性或晚期NK，可以考虑自体血清滴眼液、睑板修补术、羊膜移植、结膜瓣移植，甚至角膜移植手术。近年来，一系列关于重组人神经生长因子(rhNGF)滴眼液的研究已经成为治疗NK的新选择。虽然它能促进角膜上皮和感觉神经纤维的再生，但其治疗时间长，局部应用频繁，对患者的依从性要求高。制备和纯化过程复杂，治疗成本高，限制了rhNGF的临床应用。
[0004]AAV由于其独特的特点，如组织趋向性、低免疫反应、不整合到宿主染色体、基因表达时间长等，在基因治疗中得到了广泛的应用。很多眼底疾病的AAV基因治疗已开展相关临床实验，但目前尚没有关于AAV基因治疗在角膜相关疾病的应用。

技术实现思路
r/>[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种过表达神经生长因子的AAV载体、含有所述AAV载体的重组病毒，可在角膜基质高表达神经生长因子(NGF)蛋白。
[0006]本专利技术的目的还在于提供过表达神经生长因子的AAV载体、含有所述AAV载体的重组病毒在制备治疗角膜神经损伤相关疾病产品中的应用。
[0007]本专利技术的目的还在于提供含过表达神经生长因子的AAV载体、含有所述AAV载体的重组病毒的注射剂，可通过一次角膜基质注射有效治疗角膜神经损伤相关疾病。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种过表达神经生长因子的AAV载体，所述载体携带外源性目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]优选的，所述载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV
‑
PHP.eB、AAV
‑
PHP.S、AAV
‑
PHP.B、AAV
‑
DJ、AAV
‑
Retro及其基础上改造的变体中的任意一种。
[0011]本专利技术还提供了含有上述AAV载体的重组病毒。
[0012]本专利技术还提供了上述AAV载体或上述重组病毒在制备治疗角膜神经损伤相关疾病
产品中的应用。
[0013]优选的，所述疾病包括神经营养性角膜病变和糖尿病角膜神经损伤。
[0014]本专利技术还提供了一种治疗角膜神经损伤相关疾病的注射剂，所述注射剂含有上述AAV载体或上述重组病毒。
[0015]优选的，所述注射剂中AAV载体或重组病毒的含量不低于1
×
103VG。
[0016]优选的，所述注射剂中还包括药学上可接受的辅料。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]本专利技术提供的过表达神经生长因子的AAV载体、含有所述AAV载体的重组病毒可有效恢复角膜神经损伤，通过一次角膜基质注射后能持续表达神经生长因子并维持3月以上，同时可沿神经纤维顺行和逆行传递，有效治疗角膜神经损伤相关疾病，弥补了传统神经生长因子滴眼液作用时间短、长期高频率给药、停药后疾病反复的缺陷，对患者依从性要求低，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0019]图1：AAV载体质粒线性结构图谱；
[0020]图2：AAV载体携带的外源性基因表达效果；
[0021]图3：角膜基质注射AAV
‑
NGF重组病毒后关键mRNA和蛋白表达效果；
[0022]图4：辣椒素模型小鼠实验结果；
[0023]图5：HSV
‑
1感染模型小鼠实验结果；
[0024]图6：视神经钳夹模型小鼠实验结果；
[0025]图7：糖尿病角膜病变模型小鼠实验结果。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种过表达神经生长因子(NGF)的AAV载体，所述载体携带外源性目的基因，所述目的基因为NGF基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本专利技术所述AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV
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PHP.eB、AAV
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PHP.S、AAV
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PHP.B、AAV
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DJ、AAV
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Retro及其基础上改造的变体中的任意一种。
[0027]本专利技术还提供了含有上述AAV载体的重组病毒，所述重组病毒优选为重组腺相关病毒。
[0028]本专利技术所述AAV载体或含有所述AAV载体的重组病毒采用常规的构建方法得到。
[0029]本专利技术还提供了所述AAV载体或含有所述AAV载体的重组病毒在制备治疗角膜神经损伤相关疾病产品中的应用，所述疾病包括神经营养性角膜病变和糖尿病角膜神经损伤。
[0030]本专利技术还提供了一种治疗角膜神经损伤相关疾病的注射剂，所述注射剂含有所述AAV载体或所述重组病毒。本专利技术所述注射剂可直接通过一次角膜基质注射，在角膜基质处高表达NGF蛋白，并持续发挥治疗角膜神经损伤相关疾病的作用长达3月以上。
[0031]本专利技术所述注射剂中AAV载体或重组病毒的含量不低于1
×
103VG。优选的，本专利技术所述注射剂中AAV载体或重组病毒的浓度范围为1
×
103～1
×
10
15
VG/μL，体积范围为1μL～
1000μL。
[0032]本专利技术所述注射剂中还包括药学上可接受的辅料。
[0033]下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0034]下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0035]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]本专利技术具体实施例中采用的AAV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种过表达神经生长因子的AAV载体，其特征在于，所述载体携带外源性目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的AAV载体，其特征在于，所述载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV
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PHP.eB、AAV
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PHP.S、AAV
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PHP.B、AAV
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DJ、AAV
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Retro及其基础上改造的变体中的任意一种。3.含有如...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢立信，张碧凝，丛林，周庆军，
申请(专利权)人：山东第一医科大学附属眼科研究所山东省眼科研究所，山东第一医科大学附属青岛眼科医院，
类型：发明
国别省市：