一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开的是一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法及其应用，筛选LGR5启动子的核心序列；表达MDA

【技术实现步骤摘要】
一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种病毒的构建方法，更具体一点说，涉及一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法，属于基因工程领域。

技术介绍

[0002]结肠癌已成为全球第三大常见癌症，高转移率和高复发率成为结肠癌患者预后不良的重大威胁，所以，寻找一种能够有效消灭肿瘤细胞同时又能提高患者生存质量的治疗方法，成为所有人的殷切期盼。LGR5是靶向抗肿瘤治疗的潜在表面表达生物标志物，基于LGR5的靶向治疗可能为抗结肠癌治疗提供潜在的机会。AAV免疫原性极低，并且与引起人类疾病没有直接的联系等独特优势，近些年很受研究者的关注。溶瘤腺病毒优先选择在肿瘤细胞中复制并将其裂解，而不损伤健康组织，并且腺病毒本身既是基因递送工具也是免疫治疗剂。ICIs通过释放T细胞的抑制性制动器分子起作用，从而产生免疫系统的稳健激活和有效的抗肿瘤免疫反应，虽然针对PD1/PDL1的抗体和CTLA
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4的研究取得了很好的效果，但TIM3的研究还不够透彻。目前，借助AAV靶向治疗恶性肿瘤的研究相对较少，在结肠癌中的研究更是鲜有报道。搭载LGR5启动子特异性靶向结肠癌的溶瘤腺病毒还没有文献报道，而在因此结肠癌中检测到高水平的TIM3表达。将LGR5特异性启动子分别克隆进入AAV和OAd，以期增强靶向能力，此外，将AAV联合多功能因子MDA
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7/IL24用于结肠癌治疗，用腺病毒携带TIM3抗体，探究rAAV和重组腺病毒对结肠癌的抗肿瘤效应及机理，将为临床结肠癌治疗提供新的方向和参考价值。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于筛选LGR5的核心启动子区域并改造AAV，用作肿瘤特异性启动子驱动目的基因的表达，能够实现增加重组病毒的肿瘤特异性选择和增强结肠癌的靶向治疗效应，同时增加正常组织的安全性，构建了编码IL24的AAV
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lgr5
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IL24,可以在肿瘤细胞内高效表达多功能细胞因子IL24，抑制肿瘤进展和调节肿瘤免疫微环境，且免疫原性低，为今后结肠癌临床治疗和药物开发提供新思考，因此提供一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0005]一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法，如图1所示，该方法包括如下步骤：
[0006]步骤1)在数据库和文献查询筛选功能基因，筛选LGR5启动子的核心序列；
[0007]步骤2)利用基因工程技术构建了lgr5启动子驱动的表达MDA
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7/IL24基因的重组腺相关病毒rAAV
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lgr5
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IL24
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WPRE和rAAV
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lgr5
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EGFP
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WPRE；
[0008]步骤3)：采用三质粒pAAV
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gene、pAAV
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RC、pHelper共转染悬浮HRK293细胞，以实现利用悬浮293细胞建立了AAV
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lgr5
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IL24的批量生产建立悬浮HRK293包装系统；
[0009]步骤4)：从悬浮HRK293包装系统中获取AAV
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lgr5
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IL24病毒粗液；
[0010]步骤5)：密度梯度离心法纯化获的纯的重组病毒：通过氯化铯CsCl密度梯度离心进行纯化，获得纯的AAV
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lgr5
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IL24；
[0011]步骤6)：qPCR绝对定量法检测病毒颗粒数：利用荧光定量PCR检测rAAV的病毒颗粒数。
[0012]优选的，流式细胞术鉴定WPRE元件是否能够显著增强外源基因的表达。
[0013]优选的，利用qPCR、Western Blot验证重组病毒能否驱动外源基因的表达。
[0014]优选的，rAAV
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LGR5
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EGFP
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WPRE的构建(即重组质粒pAAV
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lgr5
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EGFP
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WPRE的构建)：在WPRE序列的载体PMC
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IL
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2S
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PD
‑1‑
ROR1中高保真PCR扩增WPRE片段；
[0015]具体为：将高保真PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶成像仪拍摄后确定条带大小为621bp后，切胶回收，然后用Xho I和Bgl II分别双酶切pAAV
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lgr5
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EGFP载体和WPRE片段；
[0016]将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，pAAV
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lgr5
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EGFP载体酶切后条带大小应为4911bp，WPRE片段酶切后条带大小为595bp，确认条带大小无误后，割胶回收，回收产物在连接酶的作用下连接2h；
[0017]连接产物用DH5α感受态细胞进行转化，待12h后分别挑取4个大而圆的单克隆转移至含有氨苄抗性的液体LB中摇菌12
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16h，之后进行无内毒素质粒提取，质粒命名为rAAV
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LGR5
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EGFP
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WPRE，并通过普通PCR和双酶切Xho I和Bgl II验证是否连接成功。
[0018]优选的，重组质粒pAAV
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lgr5
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IL24
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WPRE的构建(即rAAV
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lgr5
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IL24
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WPRE的构建)：
[0019]首先以pCB
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IL24为模板，高保真PCR扩增目的基因IL24片段，将高保真PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶成像仪拍摄后确定条带大小为639bp后，切胶回收，然后用BamH I和Xho I分别双酶切pAAV
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LGR5
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EGFP
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WPRE载体和目的基因IL24片段；
[0020]双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，pAAV
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lgr5
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EGFP载体酶切后条带大小应为4766bp，IL24片段酶切后条带大小为639bp，确认条带大小无误后，割胶回收，回收产物在连接酶的作用下连接2h；
[0021]连接产物用DH5α感受态细胞进行转化，待12h后分别挑取6个大而圆的单克隆转移至含有氨苄抗性的液体LB中摇菌12
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16h，之后进行无内毒素质粒提取，质粒命名为pAAV
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lgr5
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IL24
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WPRE，并通过普通PCR和双酶切Xho I和BamH I验证是否连接成功。
[0022]优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤：步骤1)在数据库和文献查询筛选功能基因，筛选LGR5启动子的核心序列；步骤2)利用基因工程技术构建了lgr5启动子驱动的表达MDA
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7/IL24基因的重组腺相关病毒rAAV
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IL24
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WPRE和rAAV
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EGFP
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WPRE；步骤3)：采用三质粒pAAV
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gene、pAAV
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RC、pHelper共转染悬浮HRK293细胞进行rAAV的批量生产，实现建立悬浮HRK293包装系统；步骤4)：从悬浮HRK293包装系统中获取rAAV
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IL24病毒粗液；步骤5)：密度梯度离心法纯化获的纯的重组病毒：通过氯化铯CsCl密度梯度离心进行纯化，获得纯的rAAV
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IL24病毒；步骤6)：qPCR绝对定量法检测病毒颗粒数：利用荧光定量PCR检测rAAV的病毒颗粒数。2.根据权利要求1所述的一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：流式细胞术鉴定WPRE元件是否能够显著增强外源基因的表达。3.根据权利要求1所述的一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：利用qPCR、Western Blot验证重组病毒能否驱动外源基因的表达。4.根据权利要求1所述的一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：rAAV
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WPRE的构建：在WPRE序列的载体PMC
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ROR1中高保真PCR扩增WPRE片段；具体为：将高保真PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶成像仪拍摄后确定条带大小为621bp后，切胶回收，然后用Xho I和Bgl II分别双酶切pAAV
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EGFP载体和WPRE片段；将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，pAAV
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EGFP载体酶切后条带大小应为4911bp，WPRE片段酶切后条带大小为595bp，确认条带大小无误后，割胶回收，回收产物在连接酶的作用下连接2h；连接产物用DH5α感受态细胞进行转化，待12h后分别挑取4个大而圆的单克隆转移至含有氨苄抗性的液体LB中摇菌12
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16h，之后进行无内毒素质粒提取，质粒命名为rAAV
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WPRE，并通过普通PCR和双酶切Xho I和Bgl II验证是否连接成功。5.根据权利要求4所述的一种靶向结肠癌的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：重组质粒pAAV
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WPRE的构建：首先以pCB
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IL24为模板，高保真PCR扩增目的基因IL24片段，将高保真PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶成像仪拍摄后确定条带大小为639bp后，切胶回收，然后用BamH I和Xho I分别双酶切pAAV
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WPRE载体和目的基因IL24片段；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，pAAV
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EGFP载体酶切后条带大小应为4766bp，IL24片段酶切后条带大小为639bp，确认条带大小无误后，割胶回收，回收产物在连接酶的作用下连接2h；连接产物用DH5α感受态细胞进行转化，待12h后分别挑取6个大而圆的单克隆转移至含有氨苄抗性的液体LB中摇菌12
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16h，之后进行无内毒素质粒提取，质粒命名为pAAV
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【专利技术属性】
技术研发人员：张慧梨，王毅刚，李强，贾晓渊，黄飚，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：