一种钝齿棒杆菌与大肠杆菌共发酵生产丁二胺的方法技术

本发明专利技术公开了一种钝齿棒杆菌与大肠杆菌共发酵生产丁二胺的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明专利技术提供的方法为：(1)制备钝齿棒杆菌CGMCC NO.0890活化种子液；(2)制备过表达精氨酸脱羧酶和胍基丁胺酶的重组大肠杆菌活化种子液；(3)共发酵：将钝齿棒杆菌种子液按体积比4～10％的接种量接种至共发酵培养基，于温度为25～40℃，转速为100～130r/min的条件下振荡培养72

【技术实现步骤摘要】
一种钝齿棒杆菌与大肠杆菌共发酵生产丁二胺的方法


[0001]本专利技术涉及一种钝齿棒杆菌与大肠杆菌共发酵生产丁二胺的方法，属于微生物发酵


技术介绍

[0002]丁二胺(Putrescine，腐胺)，作为合成高性能塑料尼龙4,6的前体物质，具有重要的工业价值。目前，丁二胺的规模化生产主要依赖化学合成，虽然工艺成熟，但生产原料为难以再生的石油产品，不符合可持续发展的要求，且化学反应需使用昂贵的催化剂，反应条件也相对苛刻。如专利CN106220512A中，需要通过脱水反应、减压反应并通入氢气进行反应，反应体系中还涉及到多种有机溶剂和昂贵的催化剂。因此，需要寻找一种以可再生资源为原料，绿色高效地合成丁二胺的方法。生物法因具有绿色可持续，反应条件温和，环境污染小等优势得到了广泛关注。但是生物法需要以价格昂贵的精氨酸或鸟氨酸为底物，具有成本高的缺陷，这大大阻碍了生物法生产丁二胺的工业化进程。如专利CN105925629A中，通过构建过表达鸟氨酸脱羧酶的重组菌，以鸟氨酸为底物转化生成丁二胺，丁二胺的产量仅为0.7g/L。

技术实现思路

[0003]针对现有技术存在的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种钝齿棒杆菌与大肠杆菌共发酵生产丁二胺的方法。本专利技术共培养液体发酵工艺可显著提高大肠杆菌产丁二胺水平，且无需提供昂贵的精氨酸为底物，符合产业化生产需求。
[0004]本专利技术的第一个目的是提供一种微生物制剂，所述微生物制剂包括微生物制剂A和微生物制剂B，所述微生物制剂A为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)JN
‑
1，所述微生物制剂B为重组大肠杆菌。
[0005]在一种实施方式中，所述钝齿棒杆菌JN
‑
1，记载于公开号为CN1441055A的专利中，保藏编号为CGMCC NO.0890。
[0006]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌过表达精氨酸脱羧酶和胍基丁胺酶。
[0007]在一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有精氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列，所述胍基丁胺酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有胍基丁胺酶活性的氨基酸序列。
[0008]在一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述胍基丁胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pETDuet
‑
1位表达载体，以大肠杆菌E.coli JM109为宿主细胞。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供所述微生物制剂在制备含有丁二胺产品中的应用。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种发酵生产丁二胺的方法，所述方法为先将上述微生物制剂中的微生物制剂A的种子液接种至共发酵培养基，发酵培养后再接种至含有微生
物制剂B的种子液的共发酵培养基，继续发酵培养生产丁二胺。
[0012]在一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：
[0013](1)将上述微生物制剂A接种于种子培养基A，发酵培养得种子液A；
[0014](2)将上述微生物制剂B接种于种子培养基B，发酵培养10
‑
30h得种子液B；
[0015](3)将步骤(1)所得种子液A以体积比为4～10％的接种量接种至共发酵培养基，发酵培养72
‑
120h，获得发酵液A；
[0016](4)将步骤(3)中的发酵液A接种至含有种子液B的共发酵培养基，发酵培养2～5天，获得含丁二胺的发酵液。
[0017]在一种实施方式中，步骤(1)中的发酵培养的温度为25～35℃，转速为110～150r/min。
[0018]在一种实施方式中，步骤(2)中的发酵培养的温度为35～40℃，转速为225～275r/min。
[0019]在一种实施方式中，步骤(3)中的发酵培养的温度为25～40℃，转速为100～130r/min。
[0020]在一种实施方式中，步骤(4)中的种子液B以体积比为1.0～1.5％的接种量接种至共发酵培养基。
[0021]在一种实施方式中，步骤(4)中的发酵液A以体积比为2～3％的接种量接种至共发酵培养基。
[0022]在一种实施方式中，步骤(4)中发酵培养的温度为30～40℃，转速为300～350r/min。
[0023]在一种实施方式中，所述共发酵培养基成分以g/L计为硫酸铵25～35，蔗糖55～65，MgSO4·
7H2O 3～7，KH2PO
4 25～35，MnSO4·
H2O 0.02，FeSO4·
7H2O 0.02，VB
1 0.00045，生物素0.00005，碳酸钙25～35，酵母粉3～7，蛋白胨15～25，NaCl 0.5，MgCl
2 0.95，KCl 0.186，其余为水。
[0024]在一种实施方式中，步骤(1)中的种子培养基A的成分以g/L计为葡萄糖15～25，蛋白胨8～12，酵母浸出液3～7，牛肉膏8～12，NaCl 2～4，其余为水。
[0025]在一种实施方式中，步骤(2)中的种子培养基B的成分以g/L计为酵母粉3～7，蛋白胨8～12，NaCl 8～12，其余为水。
[0026]本专利技术还提供所述方法在制备含有丁二胺的产品中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果如下：
[0028]1、本专利技术首次将钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)JN
‑
1与重组大肠杆菌E.coli JM109/pETDuet
‑
speA
‑
speB共发酵技术运用于生产丁二胺，证实在一定工艺条件下，钝齿棒杆菌和大肠杆菌可以联产丁二胺，本专利技术提供的生产丁二胺的方法以硫酸铵为底物，不需要外加精氨酸，相比以精氨酸为底物的传统发酵工艺，成本下降100％。
[0029]2、本专利技术通过5L发酵罐产丁二胺最高可达55g/L，转化率高达76％，相比传统发酵工艺，转化率提高了90％，本专利技术提供的方法符合产业化生产需求，为微生物发酵产丁二胺工业提供了新的思路和途径。
具体实施方式
[0030]以下通过实施例对本专利技术进行具体说明。
[0031]如无特殊说明，以下实施例所涉及各原料和试剂均为国产或进口分析纯商品，涉及实验方法均为本领域常规方法。
[0032]下述实施例中涉及到的生物材料：
[0033]1、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)JN
‑
1：记载于公开号为CN1441055A的专利中，保藏编号为CGMCC NO.0890(此菌株在专利申请文本中的菌株编号为SDNN403，专利技术人在实验过程中将其重新编号为JN
‑
1)。
[0034]2、大肠杆菌：重组菌株E.coli JM109/pETDue本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包括微生物制剂A和微生物制剂B，所述微生物制剂A为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)JN
‑
1，所述微生物制剂B为重组大肠杆菌；所述钝齿棒杆菌JN
‑
1保藏编号为CGMCC NO.0890；所述重组大肠杆菌过表达精氨酸脱羧酶和胍基丁胺酶。2.根据权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有精氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列，所述胍基丁胺酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有胍基丁胺酶活性的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于，所述重组大肠杆菌以pETDuet
‑
1为表达载体，以大肠杆菌E.coli JM109为宿主细胞。4.权利要求1～3任一所述微生物制剂在制备含有丁二胺产品中的应用。5.一种发酵生产丁二胺的方法，其特征在于，是将权利要求1～3任一所述微生物制剂接种至共发酵培养基进行共发酵生产丁二胺。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的微生物制剂A的种子液接种至共发酵培养基，发酵培养后再接种至含有权利要求1所述的微生物制剂B的种子液的共发酵培养基，继续发酵培养生产丁二胺。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，李国辉，李沂馨，王莉，丁博，毛银，周胜虎，赵运英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：