【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于RNA合成的组合物和方法
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求于2020年10月23日提交的美国临时申请号63/104,735的权益，所述临时申请通过引用全文并入本文。
技术介绍
[0003]因为RNA分子在细胞中起着重要且多样的作用，所以基于RNA的治疗剂已经成为治疗各种疾病的有吸引力的药物类别。通过递送感兴趣的基因的信使RNA(mRNA)或非编码RNA(诸如微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA))和反义寡核苷酸(ASO)来调节基因表达，使得在RNA治疗剂方面取得了重大进展。另外，簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)
‑
CRISPR相关(Cas)蛋白系统的向导RNA(gRNA)在将CRISPR
‑
Cas系统导向至靶位点进行基因组编辑方面起着至关重要的作用。使用合成RNA代替质粒DNA提供了一种更可靠的方法，其中由于RNA分子的半衰期相对较短，脱靶活性被最小化。
[0004]当前可用的RNA合成方法包括用于短RNA分子的化学合成和诸如用于长RNA分子的体外转录(IVT)的酶促合成。虽然化学合成提供了纯的高质量RNA分子，并且提供了各种位置特异性定制修饰，但是它具有昂贵的扩展成本和低速度的问题。IVT提供了一种较便宜的解决方案，然而它往往容易出错，是劳动密集型的，并且允许有限的序列编辑。仍然需要开发一种快速、准确、自动化、可扩展且具有成本效益的RNA合成平台。
技术实现思路
[0005]在一方面，本文提供了一种用于合成RNA的方法，其包括
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于合成RNA的方法，其包括：提供固定在表面上的RNA聚合酶；和以至少50个核苷酸/小时的延伸速率合成多个RNA，其中所述多个RNA中的每一个具有预先选择的序列，并且其中所述合成包括在延伸反应中以单个碱基延伸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个RNA中的每一个包括向导RNA(gRNA)。3.如权利要求1所述的方法，其中所述多个RNA中的每一个选自信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、RNA适配体、转运RNA(tRNA)和反义寡核苷酸(ASO)。4.如权利要求1所述的方法，其中所述合成用模板DNA进行。5.如权利要求4所述的方法，其中所述模板DNA固定在所述表面上。6.如权利要求5所述的方法，其中所述模板DNA通过接头、生物素或链霉亲和素固定在所述表面上。7.如权利要求4所述的方法，其中所述模板DNA包括单链DNA(ssDNA)。8.如权利要求4所述的方法，其中所述模板DNA包括双链DNA(dsDNA)。9.如权利要求4所述的方法，其中所述模板DNA包括二级结构。10.如权利要求9所述的方法，其中所述二级结构包括发夹。11.如权利要求4所述的方法，其中所述模板DNA包含启动子序列。12.如权利要求11所述的方法，其中所述启动子序列是截短启动子序列。13.如权利要求1所述的方法，其中所述延伸速率是至少50个核苷酸/分钟。14.如权利要求1所述的方法，其中所述延伸速率是至少50个核苷酸/秒。15.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA聚合酶选自噬菌体RNA聚合酶、细菌RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶。16.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA聚合酶通过用标准N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)官能团对所述表面进行活化来固定在所述表面上。17.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA聚合酶通过用三氟乙酸酐(TFAA)官能团对所述表面进行活化来固定在所述表面上。18.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA聚合酶通过用戊二醛(GA)官能团对所述表面进行活化来固定在所述表面上。19.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是固体表面。20.如权利要求19所述的方法，其中所述固体表面包括磁珠、琼脂糖珠、熔融二氧化硅、溶胶
‑
凝胶、二氧化硅聚合物、二氧化硅单块、纤维素、琼脂、丙烯酰胺、金珠或凝胶基质。21.如权利要求1所述的方法，其中所述多个RNA中的每一个具有相同的预先选择的序列。22.如权利要求1所述的方法，其中所述多个RNA包括包含不同的预先选择的序列的至少两个RNA。23.如权利要求1所述的方法，其中所述多个RNA包括具有化学修饰的至少一个gRNA。24.一种用于合成RNA的方法，其包括：提供融合RNA聚合酶或其功能片段或变体；和以至少50个核苷酸/小时的延伸速率合成多个RNA，其中所述多个RNA中的每一个具有
预先选择的序列，并且其中所述合成包括在延伸反应中以单个碱基延伸。25.如权利要求24所述的方法，其中所述融合RNA聚合酶包含RNA聚合酶或其功能片段或变体和DNA结合蛋白或其功能片段或变体，其中所述RNA聚合酶和所述DNA结合蛋白是异源的。26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述融合RNA聚合酶还包含接头。27.如权利要求25所述的方法，其中所述RNA聚合酶选自噬菌体RNA聚合酶、细菌RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶。28.如权利要求25所述的方法，其中所述DNA结合蛋白与所述RNA聚合酶的N末端融合。29.如权利要求25所述的方法，其中所述DNA结合蛋白与所述RNA聚合酶的C末端融合。30.如权利要求24所述的方法，其中所述多个RNA中的每一个包括向导RNA(gRNA)。31.如权利要求24所述的方法，其中所述多个RNA中的每一个选自信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、RNA适配体、转运RNA(tRNA)和反义寡核苷酸(ASO)。32.如权利要求24所述的方法，其中所述合成用模板DNA进行。33.如权利要求32所述的方法，其中所述模板DNA包括单链DNA(ssDNA)。34.如权利要求32所述的方法，其中所述模板DNA包括双链DNA(dsDNA)。35.如权利要求32所述的方法，其中所述模板DNA包括二级结构。36.如权利要求35所述的方法，其中所述二级结构包括发夹。37.如权利要求32所述的方法，其中所述模板DNA包含启动子序列。38.如权利要求37所述的方法，其中所述启动子序列是截短启动子序列。39.如权利要求24所述的方法，其中所述延伸速率是至少50个核苷酸/分钟。40.如权利要求24所述的方法，其中所述延伸速率是至少50个核苷酸/秒。41.如权利要求24所述的方法，其中所述多个RNA中的每一个具有相同的预先选择的序列。42.如权利要求24所述的方法，其中所述多个RNA包括包含不同的预先选择的序列的至少两个RNA。43.如权利要求24所述的方法，其中所述多个RNA包括具有化学修饰的至少一个gRNA。44.一种核酸文库，其包含：多个纯化的向导RNA(gRNA)；和编码截短RNA聚合酶启动子区的至少一个单链DNA(ssDNA)。45.如权利要求44所述的核酸文库，其中所述纯化的gRNA中的每一个包含长度为至少20个核苷酸的序列。46.如权利要求44所述的核酸文库，其中所述纯化的gRNA中的每一个包含长度为至少80个核苷酸的序列。47.如权利要求44所述的核酸文库，其中所述多个纯化的gRNA包括至少100,000个纯化的gRNA。48.如权利要求44所述的核酸文库，其中所述截短RNA聚合酶启动子区包含选自SEQ ID NO:3
‑
SEQ ID NO:6的序列。49.如权利要求44所述的核酸文库，其中所述多个纯化的gRNA包含经修饰的核苷酸。
50.一种核酸文库，其包含：长度为至少20个核苷酸的多个纯化的向导RNA(gRNA)；和长度为2至10个核苷酸的至少一个寡核苷酸。51.如权利要求50所述的核酸文库，其中所述多个纯化的向导RNA(gRNA)长度为包含至少80个核苷酸。52.如权利要求50所述的核酸文库，其中所述多个纯化的gRNA包括至少100,000个纯化的gRNA。53.如权利要求50所述的核酸文库，其中所述至少一个寡核苷酸长度为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。54.如权利要求50所述的核酸文库，其中所述至少一个寡核苷酸包含RNA。55.如权利要求50所述的核酸文库，其中所述至少一个寡核苷酸与纯化的向导RNA的5
’
端处或附近的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续核苷酸具有100％同一性。56.如权利要求50所述的核酸文库，其中所述至少一个寡核苷酸与纯化的向导RNA的3
’
端处或附近的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续核苷酸具有100％同一性。57.如权利要求50所述的核酸文库，其中所述多个纯化的gRNA包括具有化学修饰的至少一个gRNA。58.一种用于制备包含至少50个向导RNA(gRNA)的核酸文库的方法，所述方法包括：使用RNA聚合酶合成至少50个gRNA，其中所述至少50个gRNA中的至少一个包含与靶基因中的靶序列互补的间隔子序列，并且其中所述间隔子序列的5
’
末端核苷酸与所述靶序列的3
’
末端核苷酸互补。59.如权利要求58所述的方法，其中所述至少50个gRNA中的每一个包含与靶基因中的靶序列互补的间隔子序列，并且其中所述间隔子序列的5
’
末端核苷酸与所述靶序列的3
’
末端核苷酸互补。60.如权利要求58所述的方法，其中所述RNA聚合酶选自噬菌体RNA聚合酶、细菌RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶。61.如权利要求60所述的方法，其中所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。62.如权利要求58所述的方法，其中与包含不与所述靶序列的3
’
末端核苷酸互补的5
’
末端核苷酸的gRNA相比，所述至少50个gRNA中的每一个表现出所述靶序列的增强的编辑效率。63.如权利要求58所述的方法，其中与包含不与所述靶序列的3
’
末端核苷酸互补的5
’
末端核苷酸的gRNA相比，所述至少50个gRNA中的每一个表现出减少的脱靶编辑。64.如权利要求58所述的方法，其中所述至少50个gRNA包含缺乏5
’
末端鸟嘌呤(G)核苷酸的gRNA序列，其中所述gRNA序列长度为包含至少40个核苷酸，并且其中所述gRNA序列的5
’
末端处的至少3个连续核苷酸与基因组中所述靶序列的3
’
末端具有100％同一性。65.如权利要求64所述的方法，其中与包含具有5
’
末端G核苷酸的gRNA序列的gRNA相比，所述至少50个gRNA中的每一个表现出与所述靶序列的增强的5
’
末端配对，其中所述5
’
末端G核苷酸不存在于原间隔子序列中。66.如权利要求64所述的方法，其中与包含具有间隔子序列的gRNA序列的gRNA相比，所述至少50个gRNA中的每一个表现出靶序列的增强的编辑效率，其中所述gRNA序列包含在所
述间隔子序列的5
’
末端处的一个或多个G核苷酸，其中在所述间隔子序列的5
’
末端处的所述一个或多个G核苷酸不与基因组中在所述靶序列的3
’
末端处的一个或多个核苷酸互补。67.如权利要求64所述的方法，其中与包含具有间隔子序列的gRNA序列的gRNA相比，所述至少50个gRNA中的每一个表现出减少的脱靶编辑，其中所述gRNA序列包含在所述间隔子序列的5
’
末端处的一个或多个G核苷酸，其中在所述间隔子序列的5
’
末端处的所述一个或多个G核苷酸不与基因组中在所述靶序列的3
’
末端处的一个或多个核苷酸互补。68.如权利要求58所述的方法，其中所述至少50个gRNA包含在5
’
末端密码子中缺乏鸟嘌呤(G)核苷酸的gRNA序列，其中所述gRNA序列长度为包含至少40个核苷酸，并且其中所述gRNA序列的5
’
末端处的至少3个连续核苷酸与基因组中所述靶序列的3
’
末端具有100％同一性。69.如权利要求68所述的方法，其中与包含在5
’
末端密码子中具有G核苷酸的gRNA序列的gRNA相比，所述至少50个gRNA中的每一个表现出与所述靶序列的增强的5
’
末端配对，其中所述5
’
末端密码子中的所述G核苷酸不存在于原间隔子序列中。70.如权利要求68所述的方法，其中与包含具有间隔子序列的gRNA序列的gRNA相比，所述至少50个gRNA中的每...
【专利技术属性】
技术研发人员：布兰登，
申请(专利权)人：斯宾德尔生物科技公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。