利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺制造技术

本发明专利技术属于微生物发酵生产黄原胶技术领域，公开了利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺，其包括如下步骤：步骤1)菌株活化，步骤2)黄原胶发酵生产种子液制备，步骤3)黄原胶发酵生产，将成熟种子液接种到发酵培养液中，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。量黄原胶产物。量黄原胶产物。

【技术实现步骤摘要】
利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺


[0001]本专利技术属于微生物发酵生产黄原胶
，具体涉及利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺。
技术背景
[0002]黄原胶(Xanthan gum)是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)发酵产生的一种酸性胞外杂多糖，其主链由β
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1,4糖苷键连接的D
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葡萄糖构成，三糖侧链由D
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甘露糖、D
‑
葡萄糖醛酸和D
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甘露糖连接而成并通过α
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1,3糖苷键连接到主链上的葡萄糖残基上，侧链末端甘露糖残基部分发生丙酮酸化，内部甘露糖残基大部分发生乙酰化，丙酮酸和乙酰基取代的水平因菌株及其代谢环境的差异而变化，在此结构基础之上黄原胶分子能够形成更为复杂的二级及三级结构。黄原胶分子独特的结构使其水溶液具有独特的剪切稀释性能、良好的增稠性、乳化稳定性及耐酸碱环境、耐温性，因而广泛应用于食品、石油开采、医药、农业、化工等众多行业，是一种具有重要商业价值的微生物多糖。
[0003]目前，黄原胶作为增稠剂、悬浮剂广泛应用于食品、石油、农业等行业。随着应用领域扩展，对黄原胶的性能提出了更高的要求，通过提高黄原胶产品的粘度即产品耐稀释性能可在减少黄原胶使用量的情况下保持相同粘度或达到更高粘度，降低使用成本，在石油、农业等对于应用成本敏感的行业具有更好的应用前景。
[0004]黄原胶的产量和性能受发酵菌株和发酵生产工艺的影响。现有技术对产黄原胶的原始菌株进行了基因工程改良，获得产量和性能改善的基因工程菌。例如：
[0005]CN103695453 A公开了一种编码巯基
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二硫键氧化还原酶基因在黄原胶生产中的应用，用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌，该基因工程菌携带该基因的重组质粒pL0495,通过将pL0495导入野油菜黄单胞菌野油菜变种的野生型菌株8004获得。研究发现，Xcc8004菌株基因组中编码巯基
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二硫键氧化还原酶基因与黄原胶产量有关，该基因可用于构建，选育黄原胶高产的基因工程菌株。
[0006]“野油菜黄单胞菌中gumD基因的过表达对产黄原胶的影响，中国生化药物杂志”，在野油菜黄单胞菌中过量表达产胶基因gumD，提高黄原胶发酵产量和质量。通过PCR扩增，将重组质粒pBBR
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gumD转入原始菌Xc58。结果工程菌与原始菌相比，黄原胶产量提高11.19％，黏度提高6.31％,重均分子质量提高20.21％，乙酰基含量提高77.07％，丙酮酸含量下降6.34％。结论改造后的菌株的黄原胶发酵产量和质量都较原始菌株有所提高。
[0007]也有现有技术对黄原胶发酵工艺进行了改进，例如：CN101560537A公开一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法,将发酵培养阶段设计为基础培养基发酵培养阶段包括补料培养基A流加,料培养基B流加，pH调控环节。在严格控制发酵液光密度的情况下依次分两步流加淀粉和含有淀粉质粗农产品，逐步增加碳氮比,通过酸碱中和液控制发酵pH值,达到了将工艺发酵时间从60
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75小时缩短至40
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48小时,高成本的工业原料改进为低成本的初农产品替代，原料成本降低15～20％,发酵时间缩短使能源消耗降低25～30％，通过试验数据表明，原料转化率达到85～90％，黏度提高10～20％。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题提高黄原胶产品的性能，使得低浓度溶液具有高粘度。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺。
[0009]本专利技术是通过以下技术方案实现的。
[0010]利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
[0011]步骤1)菌株活化：
[0012]将基因工程菌Xanthomonas campestrisΔgumF
‑
27接种于斜面LB培养基上，32℃静置培养1天，获得活化菌种；
[0013]步骤2)黄原胶发酵生产种子液制备：
[0014]挑取经斜面活化培养的菌种，接种于种子培养液里，32℃培养20h，获得成熟种子液；
[0015]步骤3)黄原胶发酵生产：
[0016]将成熟种子液接种到发酵培养液中，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。
[0017]优选地，所述分阶段控制发酵条件为：
[0018]0‑
18h：温度32℃、pH自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08MPa、溶解氧30％；18
‑
60h：温度28℃、每隔6h流加碱液调控发酵液pH至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08MPa、溶解氧10％。
[0019]优选地，所述种子培养液由如下组分组成：玉米淀粉20g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L,硫酸锰1ppm,聚醚消泡剂0.2g/L,其他为水,pH 7.0
‑
7.2。
[0020]优选地，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/L，甘油10g/L，大豆蛋白胨2g/L，NaCl 2g/L，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.22ppm，其他为水；pH 7.0
‑
7.2。
[0021]更优选地，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/L，甘油10g/L，大豆蛋白胨2g/L，NaCl 2g/L，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.2g/L，甜菜碱10
‑
50g/L，其他为水；pH 7.0
‑
7.2。
[0022]优选地，所述Xanthomonas campestrisΔgumF
‑
27菌种按照如下方法构建：将敲除质粒pK18mobSacB
‑
ΔgumF转入到Xanthomonas campestris NRRL B
‑
1459，筛选出gumF基因敲除的工程菌株Xanthomonas campestrisΔgumF
‑
27。
[0023]优选地，所述敲除质粒pK18mobSacB
‑
ΔgumF的序列如SEQ ID NO.6所示。
附图说明
[0024]图1：pK18mobSacB
‑
ΔgumF载体图谱。
具体实施方式
[0025]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0026]为了使本领域技术人员能够更加清楚了解本专利技术公开的技术方案，以下结合具体的实施例详细说明本专利技术公开的技术方案。
[0027]实施例1
[0028]产高分子量黄原胶生产菌株工程菌株Xan本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：步骤1)菌株活化：将基因工程菌Xanthomonas campestrisΔgumF
‑
27接种于斜面培养基上，32℃静置培养1天，获得活化菌种；步骤2)黄原胶发酵生产种子液制备：挑取经斜面活化培养的菌种，接种于种子培养液里，32℃培养20h，获得成熟种子液；步骤3)黄原胶发酵生产：将成熟种子液接种到发酵培养液中，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述分阶段控制发酵条件为：0
‑
18h：温度32℃、pH自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08MPa、溶解氧30％；18
‑
60h：温度28℃、每隔6h流加碱液调控发酵液pH至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08MPa、溶解氧10％。3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述种子培养液由如下组分组成：玉米淀粉20g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L,硫酸锰1ppm,聚醚消泡剂0.2g/L,其他为水,pH 7.0
‑
7.2。4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/L，甘油10g/L，大豆蛋白胨2g/L，NaCl 2g/L，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.2g/L，其他为水；p...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵兰坤，王言东，伏广好，陈晓妮，李树标，徐淑科，周敬，许志颖，
申请(专利权)人：内蒙古阜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：