一种单因素细胞命运调控模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种单因素细胞命运调控模型的构建方法，属于生物技术领域，包括以下步骤：获得种子细胞；制备无细胞粘附位点的水凝胶溶液；构建单因素力学刺激调控模型；具体包括以下步骤：将种子细胞接种到水凝胶溶液中，并通过交联溶液交联形成水凝胶，并培养得到细胞/水凝胶复合物；将孵育后的细胞/水凝胶复合物置于微振动培养装置内，给予力学刺激。通过上述方式，本发明专利技术通过水凝胶对细胞的包埋，有效排除了流体剪切应力对细胞的影响，由于模型屏蔽流体剪切应力对细胞的应力作用，使细胞仅受到基质应力传递这一单一因素的力学作用，从而促进对于力学调控机制的深入理解。而促进对于力学调控机制的深入理解。而促进对于力学调控机制的深入理解。

【技术实现步骤摘要】
一种单因素细胞命运调控模型的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种单因素细胞命运调控模型的构建方法。

技术介绍

[0002]研究指出，细胞所处的微环境，不管是天然生理环境、植入环境、培养环境，或是2D或3D支架环境都对细胞的生物应答有影响。力学刺激往往会和细胞粘附基质的材料特性(如粘弹性、表面微形貌、化学成分等)共同调控细胞的生物学行为。由于这种复合作用的影响，尽管现在已经确认细胞会对力学刺激产生应答，但如何采取力学刺激以得到细胞最佳响应结果仍有待深入理解和探索。
[0003]此外，研究发现，机械刺激是通过基质应力传递和流体剪切应力这两种方式作用于细胞。在体内流体剪切应力来自细胞表面的液体流动，包括充满液体的血管和骨陷窝内包围细胞的组织液，并从间质液中接收剪切应力，促进骨细胞具有代谢活性。通过力学刺激引起的流体剪切应力可以引起骨细胞瞬时信号反应，还可以启动许多重要的骨细胞信使分子的释放。而对于基质应力传递作为单因素力学刺激如何调控细胞生物学行为的研究则缺乏报导。这主要是因为在以往的研究模型中，细胞往往处于多因素力学调控的微环境中，细胞粘附在材料提供的粘附位点上，同时受到流体剪切应力和基质应力传递的机械负载，以及细胞
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材料粘附带来的细胞应变作用。由于流体剪切应力因素被广泛研究，这使得材料在设计上对细胞的粘附性能的需求成为必须。目前的研究均认为特定的ECM
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细胞和细胞
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细胞的相互作用在提供空间锚定以及分配调节干细胞维持、存活和分化方面是非常重要的。在此观点下，人们普遍认为生物材料为细胞提供粘附位点也是调控细胞增殖、分化等行为所必需的。这使得目前对活性生物材料的设计研发均围绕着促细胞粘附来进行。对于缺乏粘附位点的材料，往往采取物理或化学改性的方式来提升其促细胞粘附功能，但由于额外的试剂的加入，其生物相容性又容易受到影响。其本身的生物学活性研究被极大的忽视了。
[0004]研究同时指出，材料作用于组织或细胞时往往处于力学负荷下，因此，对于力学因素调控细胞命运转归的机制研究是非常有必要的。
[0005]现有技术中存在多因素调控的模型，其包括：提取SD大鼠骨髓来源间充质干细胞(BM
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MSCs)，含10％胎牛血清的α
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DMEM培养基培养至第五代，0.25％的胰酶消化制备成细胞悬液，悬液浓度为5
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105个/ml；将细胞悬液滴加在经过灭菌的的羟基磷灰石多孔支架上，在细胞孵箱中静置2h；将复合后的细胞/支架分为静态组和动态组，动态组置于微振动培养一体装置内施加力学刺激，刺激参数为：频率为40Hz，强度为0.3g，振幅为50um，时间为30min/24h；静态组置于细胞孵箱培养；两组复合体每2天更换一次培养基；培养至1，4，7，10，14，18，22，26天后，检查力场外驱耦合下支架对细胞的增殖活性和成骨分化能力的调控作用；支架上细胞受到的力学调控因素包括流体剪切应力和基质应力传递，是一种多因素力学刺激复合调控模式。
[0006]但是其存在以下问题：材料本身提供了大量细胞粘附所需要的粘附位点，因此无法证明缺乏粘附位点的材料在力学环境下同样具有调控细胞行为的能力。
[0007]单因素分析可以促进对于调控机制的深入理解，而目前对于基质应力传递作为单因素力学刺激对于细胞调控作用，以及基质应力传递作用下缺乏粘附位点的生物材料对于细胞行为的调控作用及机制还缺乏研究和了解，这局限了对生物活性材料的开发和应用策略。
[0008]基于此，本专利技术设计了一种单因素细胞命运调控模型的构建方法以解决上述问题。

技术实现思路

[0009]针对现有技术所存在的上述缺点，本专利技术提供了一种单因素细胞命运调控模型的构建方法。
[0010]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0011]一种单因素细胞命运调控模型的构建方法，包括以下步骤：
[0012](1)获得种子细胞；
[0013](2)制备无细胞粘附位点的水凝胶溶液；
[0014](3)构建单因素力学刺激调控模型；具体包括以下步骤：
[0015](3.1)将种子细胞接种到水凝胶溶液中，并交联形成水凝胶，并培养得到细胞/水凝胶复合物；
[0016](3.2)将孵育后的细胞/水凝胶复合物置于微振动培养装置内，给予力学刺激。
[0017]更进一步的，步骤(1)具体为：将细胞置于培养基中，添加含有10％胎牛血清与1％双抗的全培养基，于37
±
1℃、4.5～5.5％CO2、饱和湿度的环境中培养，待细胞融合至80～90％后，进行传代扩大培养。
[0018]更进一步的，步骤(1)中，细胞培养24h后，采用磷酸盐缓冲液冲洗多次，加入新的全培养基。
[0019]更进一步的，步骤(1)中，每2.5～3.5天更换一次全培养基，待细胞融合率达到80％以上，进行传代培养，取第三代细胞用作种子细胞。
[0020]更进一步的，步骤(3.1)具体为：将种子细胞接种到水凝胶溶液中，并交联形成水凝胶，并在37
±
1℃、4.5～5.5％CO2、饱和湿度的环境中静置培养，得到细胞/水凝胶复合物。
[0021]更进一步的，步骤(3.2)具体为：将孵育24h后的细胞/水凝胶复合物在37
±
1℃、4.5～5.5％CO2、饱和湿度的条件下培养并添加完全培养基，将细胞/水凝胶复合物置于微振动培养装置内，并给予微振动刺激。
[0022]更进一步的，步骤(3.2)中，微振动刺激周期为10～35分钟/天，每1.5～2.5天更换一次培养基。
[0023]更进一步的，步骤(3.2)中，微振动刺激参数为：频率为0～60Hz、振幅≤50μm、强度＜0.6g。
[0024]更进一步的，步骤(3.2)中，采用机械刺激方式产生力学刺激。
[0025]有益效果
[0026]本专利技术通过无粘附位点的水凝胶包埋细胞获得基质应力传递的单因素力学刺激调控模型；采用基质应力传递这种单因素力学刺激耦合无粘附位点的材料来调控细胞的活
性和成骨能力；通过给予微振动刺激和基质屏蔽来产生单一的力学刺激，力学刺激与材料的耦合作用能够影响细胞的活性和成骨分化能力，从而证明无粘附位点的材料同样具有作为生物材料用于组织再生修复的应用可能；
[0027]本专利技术通过水凝胶对细胞的包埋，有效排除了流体剪切应力对细胞的影响，由于模型屏蔽流体剪切应力对细胞的应力作用，使细胞仅受到基质应力传递这一单一因素的力学作用，从而促进对于力学调控机制的深入理解；本专利技术通过无粘附位点的水凝胶包埋细胞，使细胞不需要粘附于基质即可在仿生理的3D空间内正常培养，从而打破人们普遍认为的生物材料为细胞提供粘附位点是调控细胞增殖、分化等行为所必需这一传统观点；本专利技术将对扩展再生修复材料的开发和应用起到有益的作用。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单因素细胞命运调控模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得种子细胞；(2)制备无细胞粘附位点的水凝胶溶液；(3)构建单因素力学刺激调控模型；具体包括以下步骤：(3.1)将种子细胞接种到水凝胶溶液中，并交联形成水凝胶，并培养得到细胞/水凝胶复合物；(3.2)将孵育后的细胞/水凝胶复合物置于微振动培养装置内，给予力学刺激。2.根据权利要求1所述的单因素细胞命运调控模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)具体为：将细胞置于培养基中，添加含有胎牛血清与双抗的全培养基，于37
±
1℃、4.5～5.5％CO2、饱和湿度的环境中培养，待细胞融合至80～90％后，进行传代扩大培养。3.根据权利要求2所述的单因素细胞命运调控模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞培养后采用磷酸盐缓冲液冲洗，并加入新的全培养基。4.根据权利要求2或3所述的单因素细胞命运调控模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，每2.5～3.5天更换一次全培养基，待细胞融合率达到80％以上，进行传代培养，取第三代细胞用作种子细胞。5.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴月皓，智伟，吴金结，朱秀鹏，方鑫，黄旭，彭雪松，汪建新，郭行，易若萱，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：