一种间充质干细胞培养液制备工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞培养液制备工艺，需准备配置细胞培养液所需的原液瓶用于盛放基础培养基；将基础培养基通过移液管和胎牛血清混合并加入营养物质和缓冲剂形成完全培养基；将所有耗材在121℃高压蒸汽下灭菌30mi n以上，同时将操作台面、手套、药品瓶口用70％乙醇擦拭；按照培养基配方的要求称量并加入适量的无菌纯水，混合均匀后用0.2um过滤器过滤灭菌；将经过消毒和质检的补充物根据所需比例加入到基础培养液中并再次通过过滤器消毒过滤；用NaOH或HC l等调节剂将培养基的pH值调至7.2

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞培养液制备工艺


[0001]本专利技术涉及间充质干细胞
，特别是涉及一种间充质干细胞培养液制备工艺。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是一种具有高分化潜能的细胞与一般的体细胞不同,拥有分化成多种身体组织,如骨骼,皮肤,心脏,神经,等等,的能力。它在再生医学上的应用个案在近年不断上升,细胞来源主要从人类组织提取并经过体外培植而获得所需数目的干细胞供治疗时使用，但由于细胞体外增植时所用的传统培养液也含有5％至20％的动物血清,如果所用血清含有不能治愈的病毒或病原体(如疯牛症的朊毒体(prion)),接受细胞治疗的病人便会因而染病,后果十分严重。由于培养液中主要刺激细胞生长的成份是血清，科学家便尝试用人类血清代替动物血清(Patent US 7,951,593 B2)。另外由于血清中刺激细胞生长的物质是一些生长因子(cytokine),亦有研究小组将不同的生长因子组合加入现有的培养基(如DMEM,RPMI)中以取代传统的细胞培养液(Jung SH et al.,2011)。
[0003]现有技术中的间充质干细胞培养液主要有以下技术方案:利用人类血清加上胰岛素及bFGF去代替动物血清以培养牙龈干细胞(Patent US 7,951,593B2)；利用5％血小板裂解物(platelet lysate)加上2IU/ml heparin代替10％牛血清去培养骨髓干细胞(Doucet C et al.,2005)；利用DMEM:F
‑
12培养基加上L
‑
glutamine,lipidconcentrate,sodium biocardonate,HEPES,insulin,transferring,putrescine,progesterone,fetuin,hydrocortisone,L
‑
ascorbic acid
‑2‑
phosphate,humanserum albumin,b
‑
FGF,TGF
‑
bate 1,但该配方不能加入抗生素培养人类骨髓干细胞(Jung SH et al.,2011)；利用GMEM培养基加上L
‑
glutamine,non essential amino acids,human bFGF,humanEGF,human thrombin,B27,N2.Glucose,ARAC,培养人类脂肪干细胞以悬浮性的方式生长(Dromard C et al.,2011)；等等，但是利用动物血清的方案中细胞容易受到动物病毒和细菌污染，无血清培养液配方十分复杂，所需材料成本比起用动物血清高，导致普及性低。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种间充质干细胞培养液制备工艺，培养并提取人多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞上清液加入到基础培养基中制备条件培养液，并经过对照实验得出其可促进间充质干细胞的增值、迁移和成脂分化，抑制成骨分化，同时配方简单，不会受到动物病毒和细菌污染。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种间充质干细胞培养液制备工艺，包括以下步骤：步骤一：准备配置细胞培养液所需的原液瓶用于盛放基础培养基；步骤二：将基础培养基通过移液管和胎牛血清混合并加入营养物质和缓冲剂形成完全培养基；步骤三：将所有耗材在121℃高压蒸汽下灭菌30min以上，同时将操作台面、手套、药品瓶口用70％乙醇擦拭；步骤四：按照培养基配方的要求称量并加入适量的无菌纯水，混合均匀
后用0.2um过滤器过滤灭菌；步骤五：将经过消毒和质检的补充物根据所需比例加入到基础培养液中并再次通过过滤器消毒过滤；步骤六：用NaOH或HCl等调节剂将培养基的pH值调至7.2
‑
7.4，并将将制作好的间充质干细胞培养基分装到无菌试管或瓶中，密封好后存放于
‑
80℃的冰箱中保存，在使用前将其解冻。
[0006]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤六中在使用制作好的间充质干细胞培养基时将其从冰箱内取出解冻并加入适当的抗生素。
[0007]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤一中使用的基础培养液为DMEM培养液。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤二中的缓冲剂为磷酸盐缓冲液。
[0009]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤五中的补充物可根据不同研究目的进行调整，例如10％的胎牛血清、5
‑
20ng/ml的人重组FGF、L
‑
抗坏血酸酸钠、牛血清白蛋白。
[0010]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤四中加入适量的无菌纯水后的培养基需要置于冰箱
‑
20℃冻存保存。
[0011]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤二中基础培养基与胎牛血清的体积比为9：1。
[0012]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤五中的补充物包括RPMI8226或U266细胞上清液。
[0013]与现有技术相比，本专利技术能达到的有益效果是：
[0014]本专利技术培养并提取人多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞上清液加入到基础培养基中制备条件培养液，并经过对照实验得出其可促进间充质干细胞的增值、迁移和成脂分化，抑制成骨分化，同时配方简单，不会受到动物病毒和细菌污染。
具体实施方式
[0015]为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，但下述实施例仅仅为本专利技术的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0016]实施例:
[0017]本专利技术公开了一种间充质干细胞培养液制备工艺，包括以下步骤：
[0018]S1：准备配置细胞培养液所需的原液瓶用于盛放基础培养基；
[0019]S2：将基础培养基通过移液管和胎牛血清混合并加入营养物质和缓冲剂形成完全培养基；
[0020]S3：将所有耗材在121℃高压蒸汽下灭菌30min以上，同时将操作台面、手套、药品瓶口用70％乙醇擦拭；
[0021]S4：按照培养基配方的要求称量并加入适量的无菌纯水，混合均匀后用0.2um过滤器过滤灭菌；
[0022]S5：将经过消毒和质检的补充物根据所需比例加入到基础培养液中并再次通过过滤器消毒过滤；
[0023]S6：用NaOH或HCl等调节剂将培养基的pH值调至7.2
‑
7.4，并将将制作好的间充质干细胞培养基分装到无菌试管或瓶中，密封好后存放于
‑
80℃的冰箱中保存，在使用前将其解冻；
[0024]所述步骤六中在使用制作好的间充质干细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞培养液制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：S1：准备配置细胞培养液所需的原液瓶用于盛放基础培养基；S2：将基础培养基通过移液管和胎牛血清混合并加入营养物质和缓冲剂形成完全培养基；S3：将所有耗材在121℃高压蒸汽下灭菌30min以上，同时将操作台面、手套、药品瓶口用70％乙醇擦拭；S4：按照培养基配方的要求称量并加入适量的无菌纯水，混合均匀后用0.2um过滤器过滤灭菌；S5：将经过消毒和质检的补充物根据所需比例加入到基础培养液中并再次通过过滤器消毒过滤；S6：用NaOH或HCl等调节剂将培养基的pH值调至7.2
‑
7.4，并将将制作好的间充质干细胞培养基分装到无菌试管或瓶中，密封好后存放于
‑
80℃的冰箱中保存，在使用前将其解冻。2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养液制备工艺，其特征在于：所述步骤六中在使用制作好的间充质干细胞培养基时将其从冰箱内取出解冻并加入适当的抗生素。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王知源，王广平，梁敏，石波云，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第五医院广州再生医学与健康广东省实验室附属医院，
类型：发明
国别省市：