一种畜用肽苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗口蹄疫病毒感染的肽苗及其制备方法，免疫该肽疫苗后可使易感动物抵抗口蹄疫病毒的感染。该疫苗结合了口蹄疫病毒衣壳蛋白ＶＰ１优势Ｂ细胞表位和强效外源Ｔ细胞表位，具有如ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示的氨基酸序列，可以通过化学合成和基因工程的方法制备，产品质量稳定、免疫效果好、安全性好，可用于保护易感动物免受口蹄疫病毒的感染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种兽用口蹄疫化学合成肽疫苗及其制备方法。
技术介绍
口蹄疫(foot and mouth disease,简称FMD)是偶蹄动物的一种高度 接触性、发热性、急性传染病，在世界各国普遍分布。其传播迅速，感 染马、牛，猪，羊等牲畜，导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降， 严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应，给流行国家和 地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。目前，口蹄疫在许多国家已经被 消灭或很好地被控制，然而近几年，它再度给养殖业带来巨大的经济损 失。1997年我国台湾口蹄疫大爆发，殃及600多个猪场，2000年在俄 罗斯爆发造成了巨大的经济损失。2001年2月在英国的爆发和流行，给 英国养殖业造成了继疯牛病和猪瘟两大疫情损害后的又一次沉重打击， 其影响甚至扩展到整个欧洲。在我国，A型FMDV、 O型FMDV、 Asial 型FMDV都有发生，Asial型FMDV在历史上仅局限于我国云南边境 地区流行，但在2004-2006年先后在我国新疆、甘肃、江苏、北京、河 南等地爆发了 Asial型口蹄疫，严重影响当地畜牧业的发展。口蹄疫病毒(FMDV)属于细小核糖核酸病毒，该属的病毒具有多 型性、易变性等特点。全世界有A、 O、 C、 Satl、 Sat2、 Sat3和Asial 7个血清型，亚型有70多个，各血清型间不存在交叉免疫，且病毒易发 生变异，这就为FMD的防治造成了很大困难。目前，我国对口蹄疫实 行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。而我国现行使用的 口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，但灭活却存在许多隐患，如疫苗生产 过程中由于不慎易引起病毒的逃逸以及灭活不完全而导致FMD的再度 暴发，不同型的毒抹间不能提供有效保护等。目前世界上很多国家已经 停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。为了克 服灭活疫苗的自身不足，FMD各种新型疫苗如可饲基因工程疫苗、蛋 白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等不断涌现，但是其在安全性、免疫效果、工艺方面都存在诸多问题，影 响了这些新型疫苗的使用。研究表明口蹄疫病毒衣壳蛋白由四种结构蛋白VP1、 VP2、 VP3 和VP4各60个组成，VP1-VP3位于衣壳蛋白的外侧，组成衣壳蛋白亚 单位，而VP4位于病毒颗粒的内部。VP1是主要的保护性抗原，其上 含有FMDV主要抗原结合位点能诱导机体产生中和抗体，研究表明， 位于VP1第134-158氨基酸之间的G-H环，C端第200-213氨基酸残基 是诱导中和抗体的主要免疫抗原位点。在本专利技术中，选择了 O型、A型 和Asial型FMDV结构蛋白VP1上第130-168位的优势B细胞表位。 同时由于口蹄疫主要以体液免疫为主，有效的疫苗应该能诱导以Th2为 主导的免疫反应。DiMarchi等曾报道，将串联有FMDV VP1第140-160 和第200-213氨基酸残基的合成肽免疫牛后，动物能抵抗病毒的感染。 但随后的研究证实，当将此类合成肽疫苗在易感动物群内大规模使用 时，却仅能提供有限的保护。究其原因，强效T细胞表位的缺乏可能是 影响该疫苗效果的一个因素。同时携带B细胞抗原表位和T细胞抗原表 位的串联肽已经被证明对牛表现出良好的免疫反应性。研究证实，在 FMDV衣壳蛋白上有多个能被牛和猪淋巴细胞识别的T细胞表位，但 对这些T细胞表位的识别明显地受到了宿主MHC多态性的限制，进而 也限制了它们在疫苗中的应用。同时研究发现，内源性的T细胞表位不 足以刺激易感动物免疫系统对口蹄疫病毒产生有效的保护。所以，提供 强效的外源T细胞表位以辅助增强易感动物的免疫应答是研究高效肽 苗的关键。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供一种能抵抗口蹄疫病毒感染的肽疫苗。 本专利技术的另一个目的是提供一种生产上述肽疫苗的方法。 为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案 本专利技术提供一种抗口蹄疫病毒的肽疫苗 其特征在于肽抗原具有如 SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。 上述肽苗，其特征在于如SEQIDNO: 1和SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的肽抗原结构是由口蹄疫病毒VP1上130-168位的B细胞表位 与如SEQIDNO: 4所示氨基酸序列的外源T细胞表位构成，两个表位 间的接头氨基酸序列为Lys-Lys。上述肽苗，其特征在于如SEQIDNO: 2所示氨基酸序列的肽抗原 结构表示为VPt B(M68-Lys曙Ala-Lys-Lys-Ala隱Lys-VPi 130_168,是由口蹄 疫病毒VP1上130-168位的两个B细胞表位串联而成，串联接头氨基酸 序歹'j为Lys國Ala-Lys-Lys-Ala-Lys 。上述肽苗，其特征在于抗口蹄疫病毒的肽抗原还可以由该型口蹄疫 病毒VP1上130-168位的两个B细胞表位串联后的SEQ ID NO: 2和 如SEQIDNO: 4所示氨基酸序列的肽构成。上述肽苗，其特征在于抗口蹄疫病毒的肽抗原由SEQIDNO: 2即 VPi 130_168-Lys-Ala-Lys-Lys-Ala-Lys- VPi 130_168肽和如SEQ ID NO: 4 所示氨基酸序列的肽按照摩尔比为1: 2的比例构成。上述肽苗，其特征在于如SEQIDNO: 4所示氨基酸序列的外源T 细胞表位来源于小反刍兽疫病毒。通过大量试验室试验在小反当兽疫病毒上找到了一段能增强口蹄 疫VP1上第130-168 ( 167)位的优势B细胞表位的强效外源T细胞表 位，然后通过一定的接头氨基酸将强效外源T细胞表位和优势B细胞表 位连接，构建了含辅助性强效外源T细胞表位和FMDV主要抗原表位 基因的多肽疫苗，并通过计算机模拟完全符合设计要求。上述的肽苗，其可以釆用化学合成的方法制备合成肽抗原。本专利技术还提供了该肽疫苗的制备方法，主要包括以下步骤(1) 抗原肽的化学合成；(2) 抗原肽的裂解、沉淀；(4) 高压液相色谱分离纯化多肽抗原；(5) 多肽疫苗的配置。上述制备方法中抗原肽的化学合成是以氨基树脂和FMOC氨基酸 为原料，逐步接上氨基酸，每步接肽反应后用乙酰咪唑封闭未反应的活 性氨基端，主要包括如下步骤(a)FMOC基团脱除用含15%-35%六氲吡咬的DMF溶液在20-26。C条件反应20-40分钟脱除氨基上保护的FMOC基团，氮气吹干， DMF洗涤树脂；(b) 接肽反应加入HOBT、 HBTU、 DIEA与FMOC保护的氨基 酸在20-28。C条件反应0.5-2.5小时，氮气吹干，DMF洗涤树脂；(c) 封闭反应使用1.5。/。-3.5。/。的乙酰咪唑在20-26。C条件反应15-30分钟。上述制备方法中抗原肽裂解沉淀操作中所使用的裂解试剂为三氟 乙酸(TFA)、苯酚(Phenol)和水(H20 )，它们的比例是卯/8/2， 裂解反应的时间为1-3小时。上述制备方法中肽抗原的分离纯化主要使用高压液相色谱，色谱条 件如下(a) ds反相色谱柱，规格19mmx250mmx5um，孔径300埃；(b) 流动相A相为含0.5。/oTFA的水，B相含0.5%TFA的乙腈。 上述制备方法中疫苗配制的方法包括如下(a) 用注射用水将肽抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗口蹄疫病毒的肽疫苗，其特征在于肽抗原具有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陶钰，邵国虎，
申请(专利权)人：陶钰，邵国虎，
类型：发明
国别省市：31[]