基于细菌的蛋白质递送制造技术

本发明专利技术涉及重组革兰氏阴性细菌菌株及其用于在个体中治疗癌症的方法中的用途。用于在个体中治疗癌症的方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于细菌的蛋白质递送


[0001]本专利技术涉及重组革兰氏阴性菌菌株及其用于个体中治疗癌症的方法中的用途。

技术介绍

[0002]细菌已经进化出了将蛋白质直接注入靶细胞1中的不同机制。耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)和沙门氏菌属(Salmonella)等细菌使用的III型分泌系统(T3SS)2的功能就像一个纳米注射器，将所谓的细菌效应蛋白注入宿主细胞。已开发T3SS用于将杂交肽和蛋白质递送到靶细胞中。在所研究的细菌很难通过遗传学操作(如砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis))的情况下，已进行了异源细菌T3SS效应蛋白的递送。通常将报告蛋白与可能的T3SS分泌信号融合，以研究实现T3SS依赖性蛋白递送所需的条件，所述报告蛋白为例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)腺苷酸环化酶、鼠DHFR或可磷酸化标签。肽递送的主要目的是进行疫苗接种。这包括病毒表位、细菌表位(李斯特菌溶胞素O(listeriolysin O))以及代表人癌细胞表位的肽。在很少数情况下，已递送功能性真核蛋白以调节宿主细胞，如纳米抗体3、核蛋白(Cre重组酶，MyoD)
4,5
或IL10和IL1ra 6
。由于在每种情况下仍有一种或多种内源效应蛋白会被编码，因此上述系统均不允许单蛋白递送。此外，所使用的载体并未以允许简单克隆编码所选蛋白质的其他DNA片段的方式进行设计，从而也阻碍了该系统的广泛应用。
[0003]允许靶向药物递送的方法是十分有意义的。例如，可以使用识别肿瘤细胞表面结构，并且在最佳情况下选择性结合肿瘤细胞的抗体。为了改善这类抗体的机制，可以将其与治疗剂或与包裹药物的脂质囊泡结合。这类囊泡的挑战之一是活性剂的恰当释放。更复杂的是治疗性蛋白质或肽的递送，尤其是在靶向细胞内机制时。已经尝试了许多替代方法来解决将治疗性蛋白质递送到真核细胞中的问题，其中包括“细胞穿透肽”(CPP)或类似技术以及多种基于纳米颗粒的方法。所有这些技术都有效率低的缺点，而且通过内吞作用而被细胞摄取的货物，其结局很可能是在溶酶体中被降解。此外，对货物载体在人体内的稳定性的需求与对其在靶细胞内的去稳定化和释放需求之间的冲突，构成了此类技术的固有问题。多种细菌已显示出，当在远端施用时，可以在恶性实体瘤内复制，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和双歧杆菌。目前，临床实践中仅使用芽孢杆菌Calmette
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rin(BCG，源自牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis))。BCG用于治疗浅表性膀胱癌，但其潜在的分子机制尚不清楚。开发能够将细菌内产生的货物递送到细胞(如癌细胞)内部其作用位点(即细菌外部)的细菌菌株，仍然是一个重大挑战。
[0004]专利技术概述
[0005]本专利技术涉及重组革兰氏阴性细菌菌株及其用于在个体中治疗癌症的方法中的用途。在一些实施方案中，本专利技术提供重组革兰氏阴性细菌菌株及其用于个体中治疗癌症的用途，其中该重组革兰氏阴性细菌菌株允许多种III型效应蛋白、以及IV型效应蛋白、病毒
蛋白和最重要地功能性真核蛋白易位进入癌细胞，例如进入恶性实体瘤的细胞。
[0006]本专利技术提供重组革兰氏阴性细菌菌株，该菌株能够表达和分泌至少两种不同的异源蛋白，且每种异源蛋白均以高峰值量表达和分泌，其中令人惊讶的，在递送入真核细胞(例如癌症细胞)后，所述异源蛋白中的每一种都保持最大活性，同时维持细菌菌株的完全肿瘤定殖(colonizing capacity)能力和优化的遗传稳定性。
[0007]在第一方面，本专利技术涉及重组革兰氏阴性细菌菌株，其包含：
[0008]i)第一多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；
[0009]ii)第二多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；
[0010]iii)第三多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；和
[0011]iv)第四多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；
[0012]其中该第一多核苷酸分子和该第二多核苷酸分子位于该革兰氏阴性细菌菌株所包含的载体上，并且该第三多核苷酸分子和该第四多核苷酸分子位于该革兰氏阴性细菌菌株的染色体上或该革兰氏阴性细菌菌株所包含的染色体外遗传元件上，条件是该染色体外遗传元件不是该第一和该第二多核苷酸分子所在的载体。
[0013]在另一方面，本专利技术涉及重组革兰氏阴性细菌菌株用作药物，所述菌株包含：
[0014]i)第一多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；
[0015]ii)第二多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；
[0016]iii)第三多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；和
[0017]iv)第四多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；
[0018]其中该第一多核苷酸分子和该第二多核苷酸分子位于该革兰氏阴性细菌菌株所包含的载体上，并且该第三多核苷酸分子和该第四多核苷酸分子位于该革兰氏阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.重组革兰氏阴性细菌菌株，其包含：i)第一多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；ii)第二多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；iii)第三多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；和iv)第四多核苷酸分子，其包含编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列符合读框地融合在编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端，其中编码来自细菌效应蛋白的递送信号的该核苷酸序列与启动子有效连接；其中所述第一多核苷酸分子和所述第二多核苷酸分子位于所述革兰氏阴性细菌菌株所包含的载体上，并且所述第三多核苷酸分子和所述第四多核苷酸分子位于所述革兰氏阴性细菌菌株的染色体上或所述革兰氏阴性细菌菌株所包含的染色体外遗传元件上，条件是该染色体外遗传元件不是所述第一多核苷酸分子和所述第二多核苷酸分子所在的载体。2.权利要求1的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中该第一多核苷酸分子的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列和该第三多核苷酸分子的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列编码相同的异源蛋白质或其片段。3.权利要求1或2的重组减毒革兰氏阴性细菌菌株，其中该第二多核苷酸分子的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列和该第四多核苷酸分子的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列编码相同的异源蛋白质或其片段。4.权利要求1
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3中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中第一多核苷酸分子中与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
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端符合读框地融合的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，和第二多核苷酸分子中与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端符合读框地融合的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，有效连接到相同的启动子上。5.权利要求1
‑
4中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中第三多核苷酸分子中与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端符合读框地融合的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，和第四多核苷酸分子中与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列的3
’
端符合读框地融合的编码异源蛋白质或其片段的核苷酸序列，有效连接到两个不同的启动子上。6.权利要求1
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5中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中异源蛋白质的片段包含100至800个氨基酸，并且具有与其所衍生自的异源蛋白质相同的功能特性。7.权利要求1
‑
6中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中来自细菌效应蛋白的递送信号是可以被该重组革兰氏阴性细菌菌株的分泌和易位系统识别并指导蛋白质从该革兰氏阴性细菌菌株递送到真核细胞的多肽序列。8.权利要求1
‑
7中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中来自细菌效应蛋白的递送
信号选自细菌T3SS效应蛋白或其N端片段、细菌T4SS效应蛋白或其N端片段、以及细菌T6SS效应蛋白或其N端片段。9.权利要求1
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7中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中来自细菌效应蛋白的递送信号是包含细菌T3SS效应蛋白或其N端片段的细菌T3SS效应蛋白。10.权利要求9的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中该细菌T3SS效应蛋白的N端片段包括该细菌T3SS效应蛋白的至少前10个氨基酸。11.权利要求1
‑
10中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中该载体是中拷贝数质粒。12.权利要求1
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11中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中该染色体外遗传元件是内源性毒力质粒。13.权利要求1
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12中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中由该第一、第二、第三和第四多核苷酸分子的核苷酸序列编码的异源蛋白质或其片段彼此独立地选自：参与诱导或调节干扰素(IFN)反应的蛋白质、参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白质、细胞周期调节物、锚蛋白重复序列蛋白、细胞信号传导蛋白、报告蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应蛋白、细菌T4SS效应蛋白和病毒蛋白、或其片段。14.权利要求1
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12中任一项的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中由该第一、第二、第三和第四多核苷酸分子的核苷酸序列编码的异源蛋白质或其片段彼此独立地选自：参与诱导或调节I型IFN反应的蛋白质，其选自cGAS、STING、TRIF、TBK1、IKKε、IRF3、TREX1、VPS34、ATG9a、DDX3、LC3、DDX41、IFI16、MRE11、DNA
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PK、RIG1、MDA5、LGP2、IPS
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1/MAVS/Cardif/VISA、Trim25、Trim32、Trim56、Riplet、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TANK、IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、PKR、TLR3、TLR7、TLR9、DAI、IFI16、IFIX、MRE11、DDX41、LSm14A、LRRFIP1、DHX9、DHX36、DHX29、DHX15、Ku70、环二核苷酸产生酶(环
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二
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AMP、环
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二
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GMP和环
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二
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：T三制药股份公司，
类型：发明
国别省市：