一种自互补检测探针、核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种自互补检测探针、核酸检测试剂盒，属于核酸检测技术领域，本发明专利技术所述自互补检测探针，自5

【技术实现步骤摘要】
一种自互补检测探针、核酸检测试剂盒


[0001]本专利技术属于核酸检测
，尤其涉及一种自互补检测探针、核酸检测试剂盒。

技术介绍

[0002]在核酸检测
，实时荧光PCR依然是应用最为广泛的检测方法，具备快速准确、单管封闭的特点。目前，荧光PCR技术已经广泛应用于遗传变异、肿瘤突变和微生物的检测。探针熔解曲线技术又称为后PCR技术，利用能与靶核酸序列特异性结合的检测探针，在扩增程序后加上一个熔解程序，通过逐渐提高温度，使荧光标记探针与靶核酸形成的双链发生熔解，形成一个具有特定熔点（Tm值）的熔解峰，根据熔点的不同可对多个靶核酸进行区分，使得单一荧光通道的可检测靶标数增多。再利用实时荧光PCR仪的多色荧光通道，则检测靶标数大大增加。但是，随着探针引物数量增多，体系很容易形成非特异性的结合和扩增，对结果造成干扰；并且由于探针的结构问题，荧光本底值较高，溶解峰较低。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种自互补检测探针、核酸检测试剂盒；所述自互补探针灵敏度高、特异性好；利用所述核酸检测试剂盒进行核酸检测时，本底值低，出峰明显，能够同时检测多个靶标的核酸，检测方法具有重要的意义。
[0004]本专利技术提供了一种自互补检测探针，自5
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端到3
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端依次包括序列S1、靶特异序列和序列S2；所述序列S1和序列S2互补，使得所述自互补检测探针形成发卡结构；所述S1序列的3
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端碱基修饰荧光基团，所述靶特异序列的5r/>′
端前5个碱基中的任意一个碱基修饰淬灭基团；所述S2序列5
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端修饰淬灭基团，3
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端进行封端；所述靶特异序列与待检测目标核酸序列互补。
[0005]优选的，所述序列S1和序列S2的长度分别为8~30nt；所述序列S1和序列S2互补后的Tm值为35~80℃。
[0006]优选的，所述序列S1或序列S2与待检测目标核酸互补碱基总数≤5，连续互补碱基数≤3，所述序列S1的3
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端碱基不与模板互补。
[0007]优选的，所述靶特异序列的长度为18~50nt，所述靶特异序列的Tm值为51℃~70℃。
[0008]本专利技术提供了一种核酸检测试剂盒，包括若干种所述的自互补检测探针，每一种所述的自互补检测探针针对特定的待检测目标核酸；不同种自互补探针上序列S1和序列S2互补后的Tm值之间的差值≥2℃。
[0009]优选的，还包括待检测目标核酸的引物组；每一种所述的自互补检测探针的靶特异序列的Tm值比对应引物Tm值高6℃以上。
[0010]本专利技术提供了一种甲型流感分型检测试剂盒，包括分别针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H2N2和H7N7的6种所述的自互补检测探针；以及分别针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H2N2和H7N7的引物组。
[0011]优选的，针对甲型流感病毒H1N1的引物组的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示针对甲型流感病毒H1N1的自互补检测探针的序列如SEQ ID No.3所示；针对甲型流感病毒H3N2的引物组的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；针对甲型流感病毒H3N2的自互补检测探针的序列如SEQ ID No.6所示；针对甲型流感病毒H5N1的引物组的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，针对甲型流感病毒H5N1的自互补检测探针的序列如SEQ ID No.9所示；针对甲型流感病毒H7N9的引物组的序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示针对甲型流感病毒H7N9的自互补检测探针的序列如SEQ ID No.12所示；针对甲型流感病毒H2N2的引物组的序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，针对甲型流感病毒H2N2的自互补检测探针的序列如SEQ ID No.15所示；针对甲型流感病毒H7N7的引物组的序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，针对甲型流感病毒H7N7的自互补检测探针的序列如SEQ ID No.18所示；优选的，还包括针对内标人核糖核酸酶P基因的自互补检测探针和引物组；针对内标人核糖核酸酶P基因的引物组的序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，针对内标人核糖核酸酶P基因的自互补检测探针的序列如SEQ ID No.21所示。
[0012]优选的，所述试剂盒使用时的扩增程序包括以下步骤：逆转录：50 ℃，10 min；预变性：98 ℃，2 min；扩增：94 ℃ 10s，58 ℃ 15s，40循环；溶解：30℃~80℃，升温速率0.1℃，采集荧光。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的自互补检测探针由于存在自互补结构，在进入扩增阶段之前，所述自互补检测探针不会与其他引物、探针形成二聚体，也不会产生非特异性扩增，检测特异性非常高。
[0014]应用本专利技术提供的自互补检测探针检测时，本底值低，峰值高；在熔解阶段，由于自互补检测探针荧光基团和淬灭基团的特殊设计，未被剪切的自互补检测探针荧光基团与猝灭基团紧邻，荧光完全淬灭；被剪切下的互补序列，荧光基团和猝灭基团接在同一对碱基上，荧光完全淬灭；因此，本底值极低，在熔解过程中，互补序列完全分离，荧光值完全激发，发光强度高。
[0015]进一步的，由于自互补序列不与模板序列互补，不受待检测基因序列的限制，故自由度高，可简单控制Tm；由于利用所述自互补检测探针检测，可以通过Tm确定待检测基因种类，基于自互补探针的特殊结构，探针分辨率可达到2℃，配合多色荧光技术，可实现一次检测几十种病原体。
附图说明
[0016]图1为本专利技术提供的自互补检测探针在不同阶段的存在状态；其中上、中、下图分别表示扩增前、扩增时、溶解前自互补检测探针的状态；图2为FAM通道甲型H1N1流感病毒的阳性检测结果；图3为FAM通道甲型H2N2病毒的阳性检测结果；图4为HEX通道甲型H5N1病毒的阳性检测结果；图5为HEX通道甲型H3N2病毒阳性检测结果；图6为Cy5通道甲型H7N9流感病毒的阳性检测结果；
图7为Cy5通道甲型H7N7流感病毒阳性检测结果；图8为ROX通道内标的阳性检测结果；图9为6种亚型混合检测结果。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供了一种自互补检测探针，自5
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端到3
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端依次包括序列S1、靶特异序列和序列S2；所述序列S1和序列S2互补，使得所述自互补检测探针形成发卡结构；所述S1序列的3
′
端碱基修饰荧光基团，所述靶特异序列的5
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端前5个碱基中的任意一个碱基修饰淬灭基团；所述S2序列5
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端修饰淬灭基团，3
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端封端；所述靶特异序列与待检测目标核酸序列互补。
[0018]在本专利技术中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自互补检测探针，其特征在于，自5
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端到3
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端依次包括序列S1、靶特异序列和序列S2；所述序列S1和序列S2互补，使得所述自互补检测探针形成发卡结构；所述S1序列的3
′
端碱基修饰荧光基团，所述靶特异序列的5
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端前5个碱基中的任意一个碱基修饰淬灭基团；所述S2序列5
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端修饰淬灭基团，3
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端进行封端；所述靶特异序列与待检测目标核酸序列互补。2.根据权利要求1所述的自互补检测探针，其特征在于，所述序列S1和序列S2的长度为8~30nt；所述序列S1和序列S2互补后的Tm值为35~80℃。3.根据权利要求1或2所述的自互补检测探针，其特征在于，所述序列S1或序列S2与待检测目标核酸互补碱基总数≤5，连续互补碱基数≤3，所述序列S1的3
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端碱基不与模板互补。4.根据权利要求1所述的自互补检测探针，其特征在于，所述靶特异序列的长度为18~50nt，所述靶特异序列的Tm值为51℃~70℃。5.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括若干种权利要求1所述的自互补检测探针，每一种所述的自互补检测探针针对特定的待检测目标核酸；不同种自互补探针上序列S1和序列S2互补后的Tm值之间的差值≥2℃。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括扩增待检测目标核酸的引物组；每一种所述的自互补检测探针的靶特异序列的Tm值比对应引物的Tm值高6℃以上。7.一种甲型流感分型检测试剂盒，其特征在于，包括分别针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H2N2和H7N7的6种权利要求1所述的自互补检测探针；以及分别针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H2N2和H7N7的引物组。8.根据权利要求7所述的甲型流感分型检...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈杰，丁少祥，孟寒寒，石芳，
申请(专利权)人：山东迪曼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：