静电纳米颗粒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及产生纳米颗粒的方法，所述方法包括(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；和(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。本发明专利技术还涉及通过本发明专利技术的方法可获得的纳米颗粒，以及涉及纳米颗粒，其包含(a)带正电荷的多肽；(b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含与带正电荷的多肽缀合的抗体；(c)一种或多种带负电荷的分子。本发明专利技术还涉及包含本发明专利技术的纳米颗粒的组合物，并且涉及用于治疗中的本发明专利技术的纳米颗粒或组合物。合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】静电纳米颗粒及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年12月2日递交的102272号卢森堡专利申请、于2021年5月21日递交的21175260.5号欧洲专利申请、于2021年10月29日递交的21205482.9号欧洲专利申请的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。


[0003]本专利技术涉及一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。本专利技术还涉及一种通过本专利技术的方法可获得的纳米颗粒，以及涉及一种纳米颗粒，其包含(a)带正电荷的多肽；(b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含与带正电荷的多肽缀合的抗体；(c)一种或多种带负电荷的分子。本专利技术还涉及包含本专利技术的纳米颗粒的组合物，并且涉及用于治疗中的本专利技术的纳米颗粒或组合物。

技术介绍

[0004]RNA抑制(RNAi)的原理对医学应用提出了很高的期望，并在2006年获得了诺贝尔奖。该方法通过选择和合成基因特异性siRNA寡核苷酸，经由使mRNA失活和随后使几乎任意基因的表达沉默而显示出高效率。虽然这种方法革新了分子生物学，但由于许多具体问题，已证明将该原理转化到治疗领域是困难的。
[0005]siRNA寡核苷酸受到核酸酶攻击，显示出改善的免疫原性和肾清除率，因此“裸siRNA”的半衰期和循环时间通常远低于预期。因此，已将siRNA与诸如纳米颗粒或胶囊的稳定剂复合。使用这些稳定剂，siRNA的循环时间和生物利用度提高，但是仍然缺乏靶细胞决定结构，所述靶细胞决定结构a)靶向具有特异性表面分子的胞，并将siRNA递送至这些细胞，和b)能够实现阴离子siRNA在阴离子细胞质膜上的靶特异性转移。
[0006]尽管已经进行了许多临床阶段研究I
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III来治疗神经系统疾病、病毒感染和癌症，但是到目前为止，FDA仅批准了一种siRNA。例如Patisiran(商品名Onpattro)是一种治疗遗传性甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的人的多神经病的药物。遗传性甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性是致命的罕见疾病，据估计其影响全世界50,000人。
[0007]为了开发治疗肿瘤疾病的模块化治疗手段，我们开发了一种系统，该系统将siRNA与针对癌细胞特异性表面分子的抗体偶联，并通过将siRNA递送到预期的癌细胞的特异性阳离子肽
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鱼精蛋白与相应的表面分子(如受体)结合，并以受体依赖性方式内化而在结合时引起内化。
[0008]鱼精蛋白是一种阳离子的核酸结合肽，其运输浓缩在精子头部中的基因组DNA的完整集合。由于鱼精蛋白能够复合核酸并促进核酸在细胞质膜中的转移，这吸引了许多研
究者来研究其在转染、靶向递送和基因疗法中的应用((Choi等，2009；Chono等，2008；Hansen等,1979；He等，2014；Liu,B.,2007)。作为核酸递送载体对鱼精蛋白进行了测试，并将其与各种细胞决定靶向部分连接。2005年，Song等(Song等，2005a)提出了一种基因融合蛋白，其连接了针对人免疫缺陷病毒HIV gp 160包膜蛋白的Fab片段(F105)和截短的鱼精蛋白肽。该融合蛋白复合了靶向HIV gag蛋白的siRNA，并且该缀合物能够靶向难以转染的HIV感染的T细胞和HIV包膜转染的黑素瘤细胞。该siRNA
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F105载体缀合物抑制感染的T细胞中HIV的复制。为了验证靶向原理，将相同的策略用于用与鱼精蛋白融合的Erb2单链抗体靶向ErbB2。由此，在许多出版物中都遵循了鱼精蛋白和细胞决定簇之间的基因融合，但从未将这个概念成功地转化到临床中。
[0009]在先前的工作中，根据N.等，2016Nat.Protoc.11,22
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36,N.等，2018PLoS One 13,e0200163；和S.等，2015Clin Cancer Res 21,1383
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94中描述的化学缀合方案，本申请的专利技术人通过双特异性交联磺基
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SMCC的手段将抗EGFR单克隆抗体(mAB)西妥昔单抗与阳离子肽鱼精蛋白缀合。所得到的IgG
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鱼精蛋白缀合物分子能够使EGF受体内化并将siRNA递送至靶细胞。
[0010]本专利技术的目的是提供进一步和优选改进的手段和方法以用于将阴离子分子递送至靶细胞。

技术实现思路

[0011]本专利技术涉及一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括(c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及(d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。
[0012]本专利技术还涉及一种纳米颗粒，所述纳米颗粒通过本专利技术的方法可获得。
[0013]本专利技术还涉及一种纳米颗粒，其包含：(a)带正电荷的多肽；(b)第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含经由双官能连接子与带正电荷的多肽缀合的抗体；以及(c)一种或多种带负电荷的分子。
[0014]本专利技术还涉及一种组合物，其包含本专利技术的纳米颗粒。
[0015]本专利技术还涉及一种本专利技术的纳米颗粒或本专利技术的组合物，其用于治疗中。
附图说明
[0016]图1：通过应用(N.等，2016)中公开的缀合方法，大量抗体
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SMCC
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鱼精蛋白缀合物的形成。反应后不耗竭过量磺基
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SMCC(如图2)，残余交联剂能够与IgG、鱼精蛋白
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SMCC和反应性磺基
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SMCC形成多种不同的缀合物。通过SDS
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PAGE可以观察到的非预期副产物的实例是：已经通过过量磺基
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SMCC被内部交联的IgG(A和B：抗
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EGFR
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mAB西妥昔单抗)，伴随有与鱼精蛋白的相同交联。此外，我们观察到高分子量IgG多聚体，其是不可还原的(A)，伴随有与鱼精蛋白的相同交联，参见凝胶B)。极端地，非预期副反应的复杂性可能导致出现云状外观(B)，其可能由所有可能的缀合物a
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d的混合物形成。HC：重链，LC：轻链。未反
应SMCC的耗竭的遗漏可能导致可能干扰预期产物(c)的功能的不期望副产物的形成。例如，反应性SMCC可导致给定IgG分子(a)中轻链与重链的交联(a)或形成IgG二聚体(d)的两个IgG分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生纳米颗粒的方法，所述方法包括c)使抗体与包含第一缀合物(A)的组合物接触，所述第一缀合物包含与双官能连接子缀合的带正电荷的多肽，其特征在于，所述组合物基本上不含未缀合的双官能连接子，从而获得第二缀合物(B)，所述第二缀合物包含所述带正电荷的多肽、所述双官能连接子和所述抗体；以及d)使所述第二缀合物(B)、带正电荷的多肽和带负电荷的分子接触，从而形成纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)之前，所述方法包括：a)将带正电荷的多肽与双官能连接子缀合；b)移除未缀合的双官能连接子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤c)中，所述第一缀合物(A)与所述抗体之间的摩尔比为至少约10:1。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述带正电荷的多肽与所述第二缀合物(B)之间的摩尔比为至少约10:1。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体对细胞表面分子具有特异性。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述带负电荷的分子为核酸。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：N，
类型：发明
国别省市：