新型L－鼠李糖异构酶制造技术

本发明专利技术提供能够在食品产业中使用的安全性高且高耐热性的L－鼠李糖异构酶、生产该L－鼠李糖异构酶的微生物以及醛糖或酮糖的制造方法。一种L－鼠李糖异构酶，其来自属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物，其中，由SDS－PAGE测定的亚基的分子质量为47kDa，具有下述(A)和(B)的底物特异性。(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性。(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型L－鼠李糖异构酶


[0001]本专利技术涉及新型的L－鼠李糖异构酶和其制造方法、生产其的微生物、编码该酶的DNA和包含该DNA的重组载体和转化宿主细胞、该酶的固定化酶和该L－鼠李糖异构酶的酮糖或醛糖的制造方法。

技术介绍

[0002]稀少糖根据国际稀少糖学会的定义，为“自然界中仅微量存在的糖”，即自然界中存在量少的单糖。
[0003]碳原子数为4的单糖(丁糖)有4种醛糖、2种酮糖和3种糖醇。碳原子数为5的单糖(戊糖)有8种醛糖、4种酮糖和4种糖醇。碳原子数为6的单糖(己糖)全部为34种，醛糖有16种，酮糖有8种、糖醇有10种。关于碳原子数为7个的单糖(庚糖)的种类，碳原子数为7的七碳醛糖、七碳酮糖、庚糖醇分别存在32种、16种、16种。
[0004]其中，通常在自然界中大量存在的醛糖为D－葡萄糖、D－半乳糖、D－甘露糖、D－核糖、D－木糖、L－阿拉伯糖的6种，除此以外的D－阿洛糖等的醛糖被定义为稀少糖。即，作为醛糖中被视为稀少糖的糖，可以列举L－阿洛糖、L－古洛糖、L－葡萄糖、L－半乳糖、L－阿卓糖、L－艾杜糖、L－甘露糖、L－塔罗糖、D－塔罗糖、D－艾杜糖、D－阿卓糖、D－古洛糖、D－阿洛糖。作为酮糖，D－果糖在自然界中大量存在，相对于此，其他酮糖在自然界不是大量地存在，因此可以被称为稀少糖。作为酮糖中被视为稀少糖的糖，可举出D－阿卢糖、D－塔格糖、D－山梨糖、L－果糖、L－阿卢糖、L－塔格糖、L－山梨糖。
[0005]近来，确立了成为所有稀少糖生产的基本原料的D－阿卢糖(别名D－psicose)的大量生产技术，使得难以获得的稀少糖的生产成为可能。进而还想到通过酶反应，D－阿卢糖会成为生产D－阿洛糖等新的稀少糖的中心。
[0006]D－阿洛糖为仅3位碳的OH基方向与D－葡萄糖不同的异构体的醛糖，也已知是酮糖的D－阿卢糖的异构体的稀少糖单糖类。D－阿洛糖已知被使用在以其作为有效成分的用于治疗选自急性肾衰竭和尿毒症的肾疾病的医药组合物(专利文献1)、用于延迟因肌萎缩侧索硬化症引发的运动障碍或其症状恶化的医药品(专利文献2)、血压上升抑制剂(专利文献3)、以用于抑制血管新生为特征的制剂(专利文献4)、T淋巴细胞增殖抑制剂(专利文献5)、或在腹膜透析液中配合使用的腹膜劣化抑制剂(专利文献6)。最近，公开了有关于被肾细胞癌细胞摄入而发挥抗肿瘤效果(专利文献7)、显示对人尿路上皮癌细胞的强抗肿瘤效果(专利文献8)的专利技术。由于这样的特征，D－阿洛糖在医药领域作为新一代的核心原材料备受瞩目，继D－阿卢糖之后要求确立D－阿洛糖的大量生产技术。
[0007]作为使用微生物生产的酶来生产D－阿洛糖的方法，本专利技术的专利技术人开发了使用从施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)分离得到的L－鼠李糖异构酶(L－rhamnose isomerase)来从阿卢糖生产阿洛糖的技术(非专利文献1)。L－鼠李糖异构酶是催化L－鼠李糖－L－鼠李树胶糖之间的可逆的异构化反应的酶，但已知来自P.stutzeri的L－鼠李糖异构酶不仅能够作用于L－鼠李糖－L－鼠李树胶糖之间，还能够作用于L－来苏糖－L－木
酮糖之间、L－甘露糖－L－果糖之间、D－古洛糖－D－山梨糖之间、D－核糖－D－核酮糖之间、D－阿洛糖－D－阿卢糖之间，L－塔罗糖－L－塔格糖之间，具有广泛的底物特异性。利用该广泛的底物特异性，以从D－阿卢糖向D－阿洛糖的转换为中心，能够生产何森图(Izumoring)上的各种各样的醛糖和酮糖。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1：日本专利第5330976号公报
[0011]专利文献2：日本专利第5317055号公报
[0012]专利文献3：日本专利第5158779号公报
[0013]专利文献4：日本专利第4943839号公报
[0014]专利文献5：日本专利第4724824号公报
[0015]专利文献6：日本特开2009－269887号公报
[0016]专利文献7：国际公开第2020/189000号
[0017]专利文献8：国际公开第2020/195037号
[0018]非专利文献
[0019]非专利文献1：J.Ferment.Biоeng.(1997)Vol.84,p.319

技术实现思路

[0020]专利技术所要解决的问题
[0021]现在，伴随着大部分稀少糖生产成为可能，被发现了生理活性的稀少糖D－阿洛糖从实验室水平的大量生产向涉及产业化的市场规模的大量生产的转变成为本专利技术人等的新的课题。而且，为了实现高效大量地生产稀少糖，筛选具有高的耐热性活性和大范围的最佳pH的酶是课题，但还需要筛选不仅具有更高的反应最佳温度、耐热性、还不易引起稀少糖的碱异构化、在更靠酸性侧具有最佳pH的酶。
[0022]如上所述在现有的技术中，以纯的稀少糖D－阿卢糖为原料，使用公知的L－鼠李糖异构酶(EC 5.3.1.14)，生产稀少糖D－阿洛糖。L－鼠李糖异构酶是催化从L－鼠李糖向L－鼠李树胶糖的异构化反应的酶，也能够催化从L－鼠李树胶糖向L－鼠李糖的异构化。已知也作用于D－阿洛糖与D－阿卢糖之间的异构化。由于异构化酶根据显示最高活性的底物来命名，所以即使在被命名为L－鼠李糖异构酶的酶中，其底物特异性也是各种各样的。
[0023]另外，该公知的酶在生成D－阿洛糖时，也是会生成作为副产物的作为醛糖的D－阿卓糖(D－altrose)的酶，作为副产物的D－阿卓糖的存在成为D－阿洛糖纯化工序中D－阿洛糖的收率降低的原因。因此，大量生产时稀少糖D－阿洛糖的纯度也成为课题之一。
[0024]本专利技术的课题在于，提供一种新型的L－鼠李糖异构酶、具有该酶的微生物以及使用该酶的制造方法，该酶来自在制造食品时允许使用且被视为无毒性的微生物，具有耐热性高且在更靠酸性侧具有最佳pH、能够高收率地从D－阿卢糖向D－阿洛糖异构化。
[0025]用于解决问题的技术方案
[0026]本专利技术人等着眼于不仅在日本而且在欧洲和美国，均登载于作为食品允许使用的清单之中的被视为基本无毒性的菌种，为此采集各地的土壤，从其中分离微生物，持续探索具有L－鼠李糖异构酶活性的微生物。
[0027]其结果，在众多分离的菌株中发现了产生新型的L－鼠李糖异构酶的属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物。作为该肠杆菌属微生物的罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)能够产生耐热性高、且在更靠酸性侧具有最佳pH的新型的L－鼠李糖异构酶。
[0028]来自该微生物的新型的L－鼠李糖异构酶能够催化醛糖与对应的酮糖之间的异构化反应，具有醛糖－酮糖之间的异构酶活性，即具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种L－鼠李糖异构酶，其中，来自属于肠杆菌(Enterobacter)属的微生物，其由SDS－PAGE测定的亚基的分子质量为47kDa，具有下述(A)和(B)的底物特异性，(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性，(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。2.如权利要求1所述的L－鼠李糖异构酶，其中，具有下述(C)和(D)的理化学的性质，(C)反应最佳pH为8，(D)反应最佳温度为80℃。3.如权利要求1或2所述的L－鼠李糖异构酶，其中，属于肠杆菌属的微生物是罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)。4.如权利要求1～3中任一项所述的L－鼠李糖异构酶，其中，属于肠杆菌属的微生物是在日本专利微生物保藏中心进行国际保藏，其保藏编号为NITE BP－03309的罗根肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)NrT7－1。5.一种以下的(a)或(b)所述的蛋白质，其中，(a)一种蛋白质，其由序列编号1所示的氨基酸序列构成，(b)一种蛋白质，其由与序列编号1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成，具有下述(A)和(B)的L－鼠李糖异构酶活性，(A)具有识别醛糖的C1的CHO基和C2的OH基并与其反应、将C1的CHO基转换成OH基、将C2的OH基转换成CO基、或识别酮糖的C1的OH基和C2的CO基并与其反应、将C1的OH基转换成CHO基、将C2的CO基转换成OH基的异构酶活性，(B)对L－鼠李糖、L－来苏糖、L－甘露糖、D－阿洛糖、D－核糖和L－塔罗糖具有反应性。6.一种DNA，其编码权利要求5所述的蛋白质。7.一种以下的(a)或(b)所述的DNA，其特征在于，(a)一种DNA，其由序列编号2所示的碱基序列构成，(b)一种DNA，其由与序列编号2所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：秋光和也，何森健，吉原明秀，加藤志郎，望月进，吉田裕美，神鸟成弘，
申请(专利权)人：国立大学法人香川大学，
类型：发明
国别省市：