一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因及在制备β-香树脂醇中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因及在制备β

【技术实现步骤摘要】
一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因及在制备
β
‑
香树脂醇中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因及在制备β
‑
香树脂醇中的应用。

技术介绍

[0002]齐墩果烷型三萜皂苷又称β
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香树脂烷型三萜皂苷，它是以齐墩果烷为苷元的五环三萜类皂苷，在植物界分布广泛，具有抗肿瘤、抗癌、抗糖尿病活性、降血糖、降血脂、保肝、抑菌等诸多药理活性(Ayeleso et al，2017)。β
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香树脂醇是齐墩果烷型化合物的骨架，是所有齐墩果烷型三萜皂苷生物合成的关键中间体。β
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香树脂醇合酶是作为齐墩果烷型皂苷生物合成支路中的第一个关键酶，它能够催化2,3
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氧化鲨烯形成齐墩果烷型皂苷骨架β
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香树脂醇(Liang&Zhao et al，2008)，随后β
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香树脂醇在由细胞色素P450依赖性单加氧酶(CYP)、糖基转移酶(UGT)介导的氧化、取代和糖基化等修饰最终生成多种类型的齐墩果烷型三萜皂苷。
[0003]青钱柳(Cyclocarya paliurus)是胡桃科青钱柳属植物。青钱柳的叶子经常被用来预防和治疗高血压、高血脂和糖尿病(Xiao et al.,2017；Tang et al.,2017)，由于其叶子具有甜味，也经常被用作凉茶。近年来的研究表明，青钱柳叶含有多种活性成分，包括三萜、黄酮类化合物、酚酸和多糖等，其中三萜及其苷类化合物是青钱柳中含量最丰富、活性最高的天然产物(Xiong et al.,2018；Xie et al.2015，Li et al.2017)，具有抗癌、降糖、抗血脂、保肝和抗炎的作用(Sun et al.,2020a；Zhou et al.,2021；Liu et al.,2014；Liu et al.,2020)。
[0004]青钱柳中三萜皂苷按照结构类型可以分为达玛烷型、齐墩果烷型、熊果烷型型和羽扇豆醇型等，其中齐墩果烷型三萜皂苷在降糖、抗癌、降血脂和保肝方面具有显著活性(Zhu et al.,2015；Gao et al.,2015；Wu et al.,2017；Yang et al.,2018)。但齐墩果烷型三萜皂苷在青钱柳中含量低，从植物材料中提取需要大量的原材料。然而，目前青钱柳现存资源多为野生状态，数量稀少且分布零散，生长年限长。因此，利用合成生物学的方法生产单体化合物是未来实现青钱柳中三萜皂苷大规模生产的最有效和可行的方法之一。然而，目前对青钱柳的研究主要集中在化合物的提取分离和药理活性鉴定，其合成的分子机理尚不清楚。要想通过生物合成的方法获得青钱柳中齐墩果烷型三萜皂苷，首先要解析这些化合物的生物合成途径，β
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香树脂醇作为齐墩果烷型三萜皂苷的关键中间体，鉴定其生物合成的酶成为重中之重。但迄今为止，负责青钱柳中β
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香树脂醇生成的相关酶功能尚未得到验证，影响了青钱柳中齐墩果烷型三萜皂苷生物合成工作的推进。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种青钱柳三萜合成酶Cp alOSC2基因，可作为齐墩果烷型三萜皂苷的生物合成中形成β
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香树脂醇调控基因以及应用
于制备β
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香树脂醇。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术第一方面提供一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因，青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长2289bp。
[0008]本专利技术第二方面提供上述青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了763个氨基酸残基。
[0009]本专利技术第三方面提供含有上述青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因的重组质粒。
[0010]进一步，优选的是，将青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因与pYES2载体同源重组，获得pYES2
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CpalOSC2重组质粒。
[0011]本专利技术第四方面提供一种转基因工程菌，含有上述重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因。
[0012]进一步，优选的是，所述转基因工程菌为酿酒酵母GIL77菌株。
[0013]本专利技术第五方面提供上述青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因编码得到的青钱柳三萜合成酶CpalOSC2。
[0014]本专利技术第六方面提供上述青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因在制备β
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香树脂醇中的应用。
[0015]进一步，优选的是，以2,3
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氧化鲨烯作为底物，在由所述的青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因编码得到的青钱柳三萜合成酶CpalOSC2的催化下，2,3
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氧化鲨烯发生碳离子重排环化生成β
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香树脂醇。
[0016]本专利技术通过重组质粒，在酿酒酵母中表达后获得目标蛋白，经进一步对底物2,3
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氧化鲨烯进行催化，直接生成β
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香树脂醇。
[0017]本专利技术所述的青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因，是从青钱柳的植株中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；经过密码子优化，通过人工合成的方法获得。所述的青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因的扩增引物如下所示：
[0018]5'F：ATGTGGAGATTGAAAATCGCTG；
[0019]3'R：TTATAGACTAGTAGATGGCAATGG。
[0020]此外，与载体pYES2进行同源重组时，CpalOSC2基因则需要使用用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：
[0021]上游同源臂引物：5'F：ttggtaccgagctcggatccATGTGGAGATTGAAAATCGCT G；
[0022]下游同源臂引物：3'R：：cggccgttactagtggatccTTATAGACTAGTAGATGGCAA TGG。
[0023]从青钱柳中分离并鉴定的三萜合酶CpalOSC2基因，可作为青钱柳的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产β
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香树脂醇及齐墩果烷型三萜皂苷的重要候选基因。
[0024]本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：
[0025]本专利技术提供青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因可作为β
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香树脂醇的生物合成调控基因，并应用于制备β
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香树脂醇。
[0026](1)随着生物信息学技术的飞速发展，极大地推进了β
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香树脂醇生物合成路径关键酶基因的挖掘，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因，其特征在于，青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有权利要求1所述的青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因的重组质粒。4.根据权利要求3所述的含有青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因的重组质粒，其特征在于，将青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因与pYES2载体同源重组，获pYES2
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CpalOSC2重组质粒。5.一种转基因工程菌，含有权利要求3所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的青钱柳三萜合...

【专利技术属性】
技术研发人员：张广辉，张双艳，杨生超，赵艳，和四梅，郝冰，向贵生，冯垒，陈庚，姜馨悦，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：