一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法技术

本发明专利技术提供了一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法，步骤如下：制备待测样品溶液：取供试多肽产品经前处理后取上清液，作为建立多肽完整分子量的测定方法的待测样品；取供试多肽产品加超纯水和胰蛋白酶溶液处理后取上清液，作为建立多肽肽图的测定方法的待测样品；样品分离：采用高效液相色谱仪对待测样品进行梯度洗脱；样品测定：采用高分辨质谱仪建立多肽完整分子量和多肽肽图的测定方法。结果分析：将结果通过BIOFinder软件进行解卷积确证解析和归属确证解析。本发明专利技术建立的一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法可对多肽样品中主成分的结构进行了确证，具有专属性强、不受制剂辅料等成分干扰、测定过程简便直接的优点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法


[0001]本专利技术涉及多肽类药物分析领域，具体涉及一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法。

技术介绍

[0002]多肽类化合物是一类重要的生物活性分子，多肽主要由氨基酸(包括天然氨基酸和非天然氨基酸)通过肽键连接而成，正是由于其结构的特性导致其与有机小分子相比，多肽药物具有更强的效力、选择性和特异性，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。常规的多肽结构确证方法为N末端序列测定的化学方法，大多是基于衍生化后的Edman化学降解法，考虑到此类方法的一些不足例如耗时较长，易受干扰，样品纯度要求比较高，使用试剂毒性较高，对于研发初期以及制剂样品的结构确证，需要专属性较高，简便快速，不易受样本杂质或辅料干扰的方法进行确证分析。基于液相色谱
‑
高分辨质谱的方法对氨基酸测序进行补充结构确证，具有特异性强、高分辨率、高质量精度的优点，可为药品结构确证提供准确、可靠且丰富的化合物信息。骨质疏松症是一个全球性的健康问题，其特征是骨量低和骨组织退化，会进一步加重骨折风险。此外，人们的发病率、死亡率、生活质量受损需要后续大量的医疗保健手段。抗骨质疏松治疗是通过控制骨翻转和改善骨密度、微结构、几何形状和材料性能来降低骨质疏松患者的骨折风险。特立帕肽为首个可用的合成代谢药物，是一种重组人甲状旁腺激素片段1
‑
34，也就是甲状旁腺激素的生物活性部分，表现出甲状旁腺激素(1
‑
84)的完全生物活性。特立帕肽和PTH的34个N
‑
端氨基酸与相关受体结合具有相同的亲和力，对骨骼和肾脏产生相同的生理学作用，与骨、肾等组织表面的受体结合，促进血钙水平升高，血磷水平下降，因此其结构的完整性以及其结构的确证尤为重要。糖尿病是一种高发的慢性代谢性疾病，是一种由于胰岛素分泌不足造成的血糖失衡疾病。目前1型糖尿病的治疗手段主要为注射胰岛素，2型糖尿病的治疗手段通常视血糖控制情况与自身并发症的程度，进行其他药物与胰岛素的结合。赖脯胰岛素是人胰岛素类似物，具有起效快、峰值高的特点，其作为速效胰岛素应用十分广泛。胰岛素在细胞层面的作用机理是通过与靶细胞表面的特异性糖蛋白结合，启动细胞内酶代谢功能，促进糖代谢。细胞上胰岛素的结合部位为特定的结合域，具有特殊的构象。此外，研究表明，胰岛素中个别氨基酸的改变可能会产生人体的过敏反应或胰岛素抵抗作用，因此目前基因重组生产的胰岛素结构特异性直接决定着胰岛素的功能与效用。与一般小分子化合物不同的是，多肽药物结构的复杂性需要从研究阶段开始进行多个层面的结构表征，以保证其功能与活性的准确性，因此，对于多肽类结构确证的方法提出了更高的专属性、准确性的要求。

技术实现思路

[0003]要解决的技术问题：本专利技术的目的在于提供一种重组多肽的高分辨质谱结构确证
方法，根据《合成多肽药物药学研究技术指导原则》和中国药典2020年版三部的要求，结合该制剂产品的特点，本专利技术建立的一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法解决了一般多肽药物结构确证方法的专属性问题，充分把控多肽类产品的质量，保证其安全性和有效性。
[0004]技术方案：一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法，所述重组多肽是由10～100个氨基酸分子通过肽键连接而形成的一类化合物，该方法具体包括如下步骤：S1：制备待测样品溶液：取供试多肽产品加超纯水溶解，离心后取上清液，作为建立多肽完整分子量的测定方法的待测样品；取供试多肽产品加超纯水溶解后添加酶溶液混匀，60℃水浴1h进行反应，最后加入浓度为50％的醋酸，离心后取上清液，作为建立多肽肽图的测定方法的待测样品；S2：样品分离：选用仪器为高效液相色谱仪，检测器为二极管阵列检测器，色谱柱为ACQUITY UPLCPeptiteCSHC18柱，柱温为25℃～60℃，流动相A为0.02
‑
0.2％的酸性水溶液，流动相B为0.02
‑
0.2％的酸性有机溶剂，采用分段梯度洗脱，流速为0.1
‑
0.3mL/min，进样量为2
‑
20μL，检测器的波长为210
‑
400nm；S3：样品测定：选用仪器为高分辨质谱仪，分辨率设置为17500、70000、140000，喷雾电压为3.5
‑
4.5KV，鞘气流速为20
‑
50arb，辅助气流速为5
‑
20arb，离子传输管温度为320
‑
400℃；ProbeheaterTemper为150
‑
400℃；S4：结果分析：将结果通过BIOFinder软件进行解卷积确证解析和归属确证解析。优选的，所述重组多肽包括重组人胰岛素、赖脯胰岛素、重组特立帕肽、阿巴洛肽、利拉鲁肽、度拉鲁肽、人胰高血糖素样肽。优选的，所述S1中酶溶液包括胰蛋白酶溶液、Glu
‑
C酶溶液、V8酶溶液和Lys
‑
C酶溶液。优选的，所述S1中离心条件为10000～13000r/min，离心10～15min。优选的，所述S1中建立多肽完整分子量的洗脱时间为15
‑
30min，洗脱条件为：按照体积百分比计，第一洗脱阶段为90％流动相A、10％流动相B等度洗脱，第二洗脱阶段为10％
→
50％～90％流动相B梯度洗脱，第三洗脱阶段为50％～90％流动相B等度洗脱，第四洗脱阶段为50％～90％
→
10％流动相B梯度洗脱，第五洗脱阶段为90％流动相A、10％流动相B等度洗脱。优选的，所述S1中建立多肽肽图的洗脱时间是40
‑
60min，洗脱条件为：按照体积百分比计，第一洗脱阶段为97％流动相A、3％流动相B等度洗脱，第二洗脱阶段为3％
→
30％～50％流动相B梯度洗脱，第三洗脱阶段为30％～50％
→
80％～95％流动相B梯度洗脱，第四洗脱阶段为80％～95％流动相B等度洗脱，第五洗脱阶段为80％～95％
→
3％流动相B梯度洗脱，第六洗脱阶段为97％流动相A、3％流动相B等度洗脱。优选的，所述S2中色谱柱规格为2.1mm
×
150mm，填充粒径1.7μm。优选的，所述S2中酸性水溶液包括甲酸水溶液、乙酸水溶液和三氟乙酸水溶液。优选的，所述S2中酸性有机溶剂包括甲酸甲醇溶液、乙酸甲醇溶液、三氟乙酸甲醇溶液、甲酸乙腈溶液、乙酸乙腈溶液和三氟乙酸乙腈溶液中的一种或多种。优选的，所述S4中BIOFinder软件S/N设置为5
‑
20，OutputMassRange设置为多肽样品分子量
±
100
‑
2000，ChargeStateRange设置为1
‑
5、1
‑
10、1
‑
15、1
‑
20，时间范围设置为质谱图中样品峰出峰时间。有益效果：本专利技术具有以下优点：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述重组多肽是由10～100个氨基酸分子通过肽键连接而形成的一类化合物，该方法具体包括如下步骤：S1：制备待测样品溶液：取供试多肽产品加超纯水溶解，离心后取上清液，作为建立多肽完整分子量的测定方法的待测样品；取供试多肽产品加超纯水溶解后添加酶溶液混匀，60℃水浴1h进行反应，最后加入浓度为50％的醋酸，离心后取上清液，作为建立多肽肽图的测定方法的待测样品；S2：样品分离：选用仪器为高效液相色谱仪，检测器为二极管阵列检测器，色谱柱为ACQUITY UPLCPeptiteCSHC18柱，柱温为25℃～60℃，流动相A为0.02
‑
0.2％的酸性水溶液，流动相B为0.02
‑
0.2％的酸性有机溶剂，采用分段梯度洗脱，流速为0.1
‑
0.3mL/min，进样量为2
‑
20μL，检测器的波长为210
‑
400nm；S3：样品测定：选用仪器为高分辨质谱仪，分辨率设置为17500、70000、140000，喷雾电压为3.5
‑
4.5KV，鞘气流速为20
‑
50arb，辅助气流速为5
‑
20arb，离子传输管温度为320
‑
400℃；ProbeheaterTemper为150
‑
400℃；S4：结果分析：将结果通过BIOFinder软件进行解卷积确证解析和归属确证解析。2.根据权利要求1所述的一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述重组多肽包括重组人胰岛素、赖脯胰岛素、重组特立帕肽、阿巴洛肽、利拉鲁肽、度拉鲁肽、人胰高血糖素样肽。3.根据权利要求1所述的一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述S1中酶溶液包括胰蛋白酶溶液、Glu
‑
C酶溶液、V8酶溶液和Lys
‑
C酶溶液。4.根据权利要求1所述的一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述S1中离心条件为10000～13000r/min，离心10～15min。5.根据权利要求1所述的一种重组多肽的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述S1中建立多肽完整分子量的洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：田怀茹，张国林，李茜，田沛霖，王思渊，张晨，
申请(专利权)人：苏州市药品检验检测研究中心苏州市药品不良反应监测中心，
类型：发明
国别省市：