无抗生素、无IPTG诱导剂的发酵生产2制造技术

本发明专利技术提供了一种无抗生素、无IPTG诱导剂的发酵生产2

【技术实现步骤摘要】
无抗生素、无IPTG诱导剂的发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵工程
，涉及一种无抗生素、无IPTG诱导剂的发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法。

技术介绍

[0002]母乳低聚糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是成熟人乳中含量最丰富的成分之一，而2
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岩藻糖基乳糖(2'
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Fucosyllactose，2'
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FL)又是HMOs中含量最高的成分，故受到了广泛的关注。2
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岩藻糖基乳糖能选择性地刺激双歧杆菌和乳杆菌等益生菌的生长，通过形成受体类似物来抑制肠道病原体对肠道的黏附，从而保护婴儿不受肠道病原体(如大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌等)的感染。
[0003]目前2
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岩藻糖基乳糖的商业化生产方法主要包括化学合成法、酶催化合成法和微生物发酵法三种方式。但是化学合成法的反应过程复杂、副产物高，难以实现高效生产，并且从合成产物中除去副产物的成本也较高。酶催化合成法的原料昂贵，催化活性较低，难以实现工业化、规模化生产。全细胞生物合成法是利用微生物进行发酵的方法，其利用大肠杆菌(Escherichia coli)活细胞以乳糖作为原料发酵生产2
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岩藻糖基乳糖，但是其存在发酵周期长、时空产率低等问题，无法满足2
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岩藻糖基乳糖的工业生产需求。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是大肠杆菌全细胞生物合成法生产2
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岩藻糖基乳糖中存在的发酵周期长、时空产率低等问题。因此，本专利技术提供一种无抗生素、无IPTG诱导剂的发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，以解决上述技术问题。利用本专利技术的重组大肠杆菌进行发酵，并对该重组大肠杆菌的发酵培养条件进行了优化，缩短了2
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岩藻糖基乳糖的发酵时间，提高了其时空产率。
[0005]本专利技术主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0006]本专利技术第一方面提供一种发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，其包括如下步骤：
[0007](1)将重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，得到初始发酵体系；
[0008](2)当所述初始发酵体系的溶解氧回升时，采用补料培养基以5～10mL/L/h的补料速度对所述初始发酵体系进行补料，并控制补料后的发酵体系的pH为6.8～7.2；
[0009](3)待所述补料后的发酵体系的OD
600
升至18～22时，将发酵温度调节至25～30℃并维持该发酵温度，加入乳糖，然后继续发酵并间断补充乳糖；发酵结束后得到2
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岩藻糖基乳糖；
[0010]所述重组大肠杆菌为lacZ基因部分失活，wacJ基因和pfkA基因缺失，lacY基因和fucT基因过表达的大肠杆菌BL21(λDE3)；
[0011]进一步，所述重组大肠杆菌过表达manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因，和/或，所述重组大肠杆菌的fucK
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fucI基因、araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因中的两种、三种、四种或五种缺失；
[0012]在某一较佳实施方案中，lacZ基因的部分失活指的是其编码产生的β
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半乳糖苷酶的表达量相对于野生型大肠杆菌而言有了大幅度降低，但是仍然具有3％至5％的β
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半乳糖苷酶的表达量。
[0013]在某一具体实施方案中，所述pfkA基因的登录号为CAQ34267.1。
[0014]在某一具体实施方案中，所述gmm基因的登录号为CAQ32463.1。
[0015]在某一具体实施方案中，所述nudK基因的登录号为CAQ32837.1。
[0016]在某一具体实施方案中，所述araA基因的登录号为CAQ30580.1。
[0017]在某一具体实施方案中，所述rhaA基因的登录号为CAQ34255.2。
[0018]在某一具体实施方案中，所述rcsA基因的登录号为WP_182557942.1。
[0019]在某一具体实施方案中，所述lacY基因的登录号为CAQ30818.2。
[0020]在某一具体实施方案中，所述manB基因的登录号为CAQ32460.1。
[0021]在某一具体实施方案中，所述manC基因的登录号为CAQ32461.1。
[0022]在某一具体实施方案中，所述gmd基因的登录号为CAQ32465.2。
[0023]在某一具体实施方案中，所述wcaG基因的登录号为CAQ32464.1。
[0024]在某一具体实施方案中，所述fucT基因的登录号为RTL12957.1。
[0025]在某一较佳实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK
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fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
[0026]araA基因和nudK基因缺失；
[0027]rhaA基因和gmm基因缺失；
[0028]araA基因和rhaA基因缺失；
[0029]araA基因和gmm基因缺失；
[0030]rhaA基因和nudK基因缺失；
[0031]nudK基因和gmm基因缺失。
[0032]在某一较佳实施方案中，所述fucT基因构建于pET28a质粒上。
[0033]在某一较佳实施方案中，所述lacY基因的过表达是lacY基因整合入大肠杆菌基因组pfkA基因处实现。
[0034]在某一较佳实施方案中，所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet
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gmd
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wcaG
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manB
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manC共表达质粒上。
[0035]在某一较佳实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK
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fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
[0036]araA基因和gmm基因缺失；
[0037]rhaA基因和nudK基因缺失；
[0038]nudK基因和gmm基因缺失；
[0039]araA基因和nudK基因缺失；
[0040]rhaA基因和gmm基因缺失；
[0041]araA基因和rhaA基因缺失；
[0042]araA基因、rhaA基因和nudK基因缺失；
[0043]araA基因、nudK基因和gmm基因缺失；
[0044]araA基因、rhaA基因和gmm基因缺失；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)将重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，得到初始发酵体系；(2)当所述初始发酵体系的溶解氧回升时，采用补料培养基以5～10mL/L/h的补料速度对所述初始发酵体系进行补料，并控制补料后的发酵体系的pH为6.8～7.2；(3)待所述补料后的发酵体系的OD
600
升至18～22时，将发酵温度调节至25～30℃并维持该发酵温度，加入乳糖，然后继续发酵并间断补充乳糖；发酵结束后得到2
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岩藻糖基乳糖；其中，所述重组大肠杆菌为lacZ基因部分失活，wacJ基因和pfkA基因缺失，lacY基因和fucT基因过表达的大肠杆菌BL21(λDE3)；进一步，所述重组大肠杆菌过表达manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因，和/或，所述重组大肠杆菌的fucK
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fucI基因、araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因中的两种、三种、四种或五种缺失；优选地，所述fucT基因的登录号为RTL12957.1。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌中，所述lacY基因的过表达是通过整合所述lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK
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fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：araA基因和nudK基因缺失；rhaA基因和gmm基因缺失；araA基因和rhaA基因缺失；araA基因和gmm基因缺失；rhaA基因和nudK基因缺失；nudK基因和gmm基因缺失；优选地，所述fucT基因构建于pET28a质粒上；和/或，所述lacY基因整合入大肠杆菌基因组的pfkA基因处；和/或，所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet
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gmd
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wcaG
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manB
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manC共表达质粒上。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK
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fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：araA基因和gmm基因缺失；rhaA基因和nudK基因缺失；nudK基因和gmm基因缺失；araA基因和nudK基因缺失；rhaA基因和gmm基因缺失；araA基因和rhaA基因缺失；araA基因、rhaA基因和nudK基因缺失；araA基因、nudK基因和gmm基因缺失；araA基因、rhaA基因和gmm基因缺失；araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因缺失；
优选地，LacY基因、fucT基因分别构建于pET28a质粒载体上；和/或，LacY基因、fucT基因共同构建于pET28a质粒载体上；和/或，所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet
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gmd
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wcaG
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manB
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manC共表达质粒上；更优选地，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsA基因，所述过表达rcsA基因是通过整合所述rcsA基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现；例如所述rcsA基因整合入大肠杆菌基因组的pfkA基因处。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：在所述补料后的发酵体系的OD
600
升至20时调节所述发酵温度至28～30℃；和/或，加入乳糖为添加终浓度为5～30g/L例如10g/L的乳糖；和/或，间断补充乳糖以调整所述乳糖的终浓度为5～30g/L例如10g/L；和/或，每隔2～4h补充乳糖；和/或，还包括发酵结束后提取2
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岩藻糖基乳糖的步骤，优选使用沸水浴的方式。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中：当所述初始发酵体系的溶解氧回升至50％以上时进行所述补料；和/或，所述补料培养基包括：500～600g/L甘油、20～30g/L蛋白胨、10～20g/L酵母提取物以及15～20g/L NaCl；和/或，所述补料培养基的补料速度为7.5～8mL/L/h；和/或，控制补料后的发酵体系的pH为6.8～7.0；和/或，在进行所述补料后控制所述补料后的发酵体系的溶解氧水平在30
±
3％的范围内。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基包括：18～20g/L甘油、12～15g/L蛋白胨、8～10g/L酵母提取物和12～15g/L NaCl；优选地，所述发酵培养基还包括镁盐；和/或，所述发酵培养基的pH为7.1～7.2；和/或，所述发酵培养基用于在发酵容器中供所述重组大肠杆菌生长，例如发酵容器为总体积为5L的发酵罐；和/或，所述重组大肠杆菌以种子液的形式接种至所述发酵培养基中；优选地，所述种子液的体积占所述发酵培养基体积的1％～10％；和/或，所述重组大肠杆菌在进行所述接种时的初始温度为35～37℃；和/或，在进行所述接种后，通过通气和/或搅拌使所述初始发酵体系的溶解氧控制在30
±
3％。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备方法包括如下步骤：将所述重组大肠杆菌接入种子培养基中，得到种子培养体系；对所述种子培养体系进行振荡培养，得到所述种子液。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括：10～12g/L蛋白胨、5～16g/L酵母提取物、10～12g/L氯化钠；还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/L甘油或1～10g/L的葡萄糖、0.01～0.15mol/L磷酸盐缓冲液、10～100mg/L酸性氨基酸和0.1～1.0mg/L维生素；较佳地，所述种子培养基包括10～12g/L蛋白胨、5～10g/L酵母提取物、10～12g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨昊，张源，闵涛玲，徐泓，刘雨柔，张志尧，李妙，
申请(专利权)人：虹摹生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：