耐热纤维素酶CelVA在降解黄原胶制黄原胶寡糖中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种耐热纤维素酶在降解黄原胶制黄原胶寡糖中的应用，所述耐热纤维素酶为耐热纤维素酶CelVA。在高温条件下能有效的切割黄原胶，切割效率高。切割效率高。切割效率高。

【技术实现步骤摘要】
耐热纤维素酶CelVA在降解黄原胶制黄原胶寡糖中的应用


[0001]本专利技术涉及一种耐热纤维素酶CelVA在降解黄原胶制黄原胶寡糖中的应用，属于生物

[0002]背景研究
[0003]黄原胶又称黄胶、汉生胶，是一种由纯培养的野油菜黄单孢菌分泌到胞外的水溶性多糖。目前，降解黄原胶的方法包括物理法、化学法、生物法。物理法降解黄原胶需要较多的仪器设备。化学法降解黄原胶会对破坏黄原胶的活性基团，对环境也有影响。生物法是一种对环境友好的方法，绿色环保。
[0004]黄原胶分子是由D
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葡萄糖、D
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甘露糖、D
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葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸构成的“五糖重复单元”构造聚合体。黄原胶主链与纤维素相似，由β
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1,4糖苷键相连的葡萄糖构成，侧链由甘露糖、葡萄糖、甘露糖三个相连的单糖构成。黄原胶的二级结构是侧链绕主链骨架反向缠绕，通过氢键维系形成棒状双螺旋结构，具有极强的稳定性。在常温条件下，黄原胶的结构非常的致密，酶的可及性低。在高温的条件下，黄原胶的结构会发生变化，会从有序的双螺旋构象变为单螺旋构象，酶的可及性提高，更有利于水解黄原胶。
[0005]黄原胶酶水解黄原胶生成的黄原胶寡糖，是一种潜在的可商业化的功能性寡糖。黄原胶寡糖具有清除羟基自由基的功能，具有激发子、抗菌和抗氧化活性。同时，黄原胶寡糖在动物饲料及食品工业有潜在的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术为了高效制备黄原胶寡糖，利用耐热纤维素酶切割黄原胶。在高温条件下，黄原胶的结构变的疏散，提高酶对黄原胶的切割效率，生成更多的黄原胶寡糖。同时，高温条件更有利于工业生产。
[0007]本专利技术发现了一种耐高温的纤维素酶CelVA，在高温条件下能有效的切割黄原胶，切割效率高。耐热纤维素酶CelVA作用于黄原胶的酶活为168.1
±
1.66U/g，是常温纤维素酶CelC7作用于黄原胶的4.6倍，是耐热纤维素酶Cel8A作用于黄原胶的1.7倍，如图2所示。
[0008]本专利技术发现的耐热纤维素酶CelVA作用于黄原胶的最适温度为80℃，温度稳定的范围非常广泛，在80℃的条件下有80％以上的活性，如图3所示。本专利技术发现的耐热纤维素酶CelVA降解黄原胶生成的黄原胶寡糖含量较高，如图6所示。
[0009]耐热纤维素酶CelVA在高温条件下能有效的切割黄原胶，切割效率高。
附图说明
[0010]图1是本专利技术的耐热纤维素酶CelVA的SDS
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PAGE电泳图，其中泳道1为空载，泳道2为粗酶液，泳道3为纯化后的CelVA，M为Marker蛋白。
[0011]图2是常温纤维素酶CelC7、耐热纤维素酶Cel8A、耐热纤维素酶CelVA作用于黄原胶的酶活对比图。
[0012]图3是耐热纤维素酶CelVA作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。
[0013]图4是常温纤维素酶CelC7作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。
[0014]图5是耐热纤维素酶Cel8A作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。
[0015]图6是原始黄原胶，常温纤维素酶CelC7、耐热纤维素酶Cel8A、耐热纤维素酶CelVA降解黄原胶生成黄原胶寡糖的液相色谱图。
具体实施方式
[0016]下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。
[0017]实施例1：
[0018]耐热纤维素酶CelVA的降解黄原胶制备黄原胶寡糖中的应用，包括如下步骤：
[0019](1)通过基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成了含有耐热纤维素酶CelVA的甘油菌，耐热纤维素酶CelVA的基因序列来源于文献(Angela Boyce,Gary Walsh.Characterisation of a novel thermostable endoglucanasefrom Alicyclobacillus vulcanalis of potential applicationin bioethanol production[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,2.)，将含有耐热纤维素酶CelVA的基因片段导入大肠杆菌中；
[0020](2)培养含有耐热纤维素酶基因的大肠杆菌；
[0021](3)将步骤(2)所得的菌液离心弃上清，沉淀依次用水和缓冲液冲洗，在利用细胞破碎仪进行破碎，破碎后离心取上清，上清即为耐热纤维素酶CelVA的粗酶液；
[0022](4)将步骤(3)所得的粗酶液进行Ni柱(生工生物工程(上海)股份有限公司家的6mL的Ni
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NTA 6FF琼脂糖纯化树脂填料)结合纯化，得到纯化的耐热纤维素酶CelVA；
[0023](5)将步骤(4)所得的纯化后的蛋白透析到缓冲溶液中；
[0024](6)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶CelVA作用于黄原胶底物，检测酶活；
[0025](7)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶CelVA作用于黄原胶底物，进行最适温度、温度稳定性的测定；
[0026](8)在步骤(7)的条件下，将耐热纤维素酶CelVA与黄原胶底物反应一段时间，将反应液煮沸，离心取上清，上清液即为黄原胶寡糖；
[0027](9)对步骤(8)得到的黄原胶寡糖进行液相色谱的分析。
[0028]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中耐热纤维素酶CelVA导入大肠杆菌的方法包括如下步骤：
[0029]a、将全基因合成的甘油菌采用四区划线的方法，在含有终浓度为30μg/mL的卡那霉素抗性的LB固体培养基平板中划线，放在37℃培养箱中，培养12h；
[0030]b、先在10mL LB(于水中的质量浓度：0.5％ NaCl 1％蛋白胨1％酵母浸粉)液体培养基中加入3μL终浓度为30μg/mL的卡那霉素，再挑取步骤a得到的单菌落到液体培养基中，放在200r，37℃的摇床中培养12h；
[0031]c、质粒提取：1)在室温下，取8mL过夜培养的菌液，在8,000g，2min条件下进行离心，倒掉上清；2)在沉淀中加入250μL Buffer P1(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，B518191，100次)，悬浮菌体；3)加入250μL Buffer P2(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，100次)，立即温和颠倒离心管混匀，室温静置2min，
使细胞裂解完全；4)加入350μL Buffer P3(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，B518191，100次)，轻柔地上下颠倒混匀，液体呈现白色絮状，12,000g，10min离心，；5)将上清液用移液枪吸入到质粒提取柱(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，B518191，100次本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.耐热纤维素酶CelVA在降解黄原胶制黄原胶寡糖中的应用。2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：于黄原胶水溶液中加入耐热纤维素酶进行黄原胶降解制备黄原胶寡糖；其降解条件为：如：温度30
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90℃，优选温度60
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80℃，更优选75
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80℃；时间5
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25min，优选时间10
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25min，更优选15
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20min；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽伟，杨帆，李宪臻，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：