一组用于食管鳞癌筛查和早期诊断的血清自身抗体标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组用于食管鳞癌筛查和早期诊断的血清自身抗体标志物及其应用。本发明专利技术属于生物医学技术领域，涉及CETN2和POFUT1自身抗体作为食管鳞癌血清肿瘤标志物用途及具体检测方法的建立。本发明专利技术通过对早期食管鳞癌患者血清和健康人血清中的差异自身抗体进行筛选，发现CETN2和POFUT1自身抗体的表达水平在早期食管鳞癌患者血清中表达明显升高；进一步研究发现CETN2和POFUT1自身抗体用于筛选食管鳞癌及癌前病变患者具有较好的临床诊断价值，据此CETN2和POFUT1自身抗体可用于作为食管鳞癌筛查的血清标志物，以及进一步制备临床诊断试剂盒。诊断试剂盒。诊断试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一组用于食管鳞癌筛查和早期诊断的血清自身抗体标志物及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
和蛋白标志物检测领域，涉及血清CETN2和POFUT1自身抗体作为临床筛查早期食管鳞癌和高级别上皮内瘤变患者的用途及检测试剂盒的制备。

技术介绍

[0002]食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，其防治迄今为止仍然是一个世界性的难题。2021年的世界癌症报告指出2020年全球食管癌新发60.41万例，同期死亡54.40万例，分别位居全部癌症的第八位和第七位。食管癌的组织病理类型主要包括食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC；简称食管鳞癌)和食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma，EADC)两种，西方国家以腺癌多见，而我国以鳞癌为主，约占全部食管癌的90％以上。
[0003]与其他实体肿瘤相似，ESCC的发生也要经过前驱病变、癌前病变、早期癌、进展期癌等各阶段的逐步进展，是多基因变化、多步骤累积的过程。癌前病变是指可以发展为癌的一种病理变化。ESCC的癌前病变主要是指食管鳞状上皮细胞的异型增生，世界卫生组织现称为上皮内瘤变(intraepithelial neoplasia)，其根据异型增生的程度和上皮累及的深度又可分为低级别上皮内瘤变(Low grade intraepithelial neoplasia,LGIN)和高级别上皮内瘤变(High grade intraepithelial neoplasia,HGIN)。及时发现早期癌患者是降低ESCC死亡率的关键之一。目前我国早期癌的检出率仅为10％左右，近90％ESCC患者就诊时已处于中晚期，5年生存率低于20％。而对于早期癌，治疗后其5年生存率可达90％以上。因此，通过各种方式对高危人群进行定期筛查，及时发现和诊断早期病例至关重要，而寻找筛查和早期诊断的方法识别食管癌前病变及早期癌并进行适当干预，是降低我国ESCC死亡率的重中之重。
[0004]目前食管早癌的筛查主要为内镜筛查。但受内镜检查的侵入性、对操作技术和人员的依赖性及筛查成本和医疗资源等的限制，目前暂不能实现广泛应用。比较而言，通过检测患者血清标志物而实现ESCC的筛查和早期诊断无疑具有独特的优势和很强的可操作性。目前有关ESCC血清标志物包括DNA类、miRNA类、长链非编码RNA、蛋白类等。但上述研究或者样本量太小或者未进行食管癌筛查和早期诊断研究，均存在不同程度检测敏感度或特异度问题，大都距临床实际应用较远。
[0005]近年来的研究发现，在肿瘤发生发展的过程中，由于机体免疫状态的变化，患者体内会出现针对某些自体细胞抗原的抗体免疫反应。这些自体细胞抗原又称为肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigens，TAAs)。由于肿瘤发生早期TAAs水平很低，利用常规蛋白检测方法无法检测到，而免疫系统能监测到该特异蛋白的存在，并引发免疫反应产生大量的抗体，起到生物信号放大作用，在出现肿瘤临床表型之前就可以通过患者体内外周血检测到针对TAAs的自身抗体，从而诊断肿瘤患者，且与TAAs相比，自身抗体在血清中相对稳定。
因此自身抗体检测方法与抗原检测方法相比具有更高的敏感度和稳定性，血清自身抗体有可能成为用于肿瘤筛查和早期诊断的非常有前景的标志物。Yao Chen等对钙结合蛋白(Calnuc)相关自身抗体的表达水平进行检测(Int J Oncol,2007,30(5):1137
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1144)，结果表明，Calnuc的多个自身抗原微阵列可能提供一种新的非侵入性方法来增强自身抗体检测在结肠癌诊断中的应用。但已报道的标志物仍缺乏在早期食管鳞癌和高级别上皮内瘤变患者(癌前病变)方面的研究。

技术实现思路

[0006]针对目前存在的问题，本专利技术提供了一组新的ESCC肿瘤血清自身抗体标志物。具体涉及CETN2和POFUT1自身抗体作为筛查早期ESCC和高级别上皮内瘤变患者的用途，以及检测该组标志物的定量检测试剂盒的建立。
[0007]本专利技术的关键在于，确定了CETN2和POFUT1自身抗体的表达水平在ESCC患者血清内高于健康对照，且两种标志物针对早期ESCC和癌前病变患者具有临床诊断价值，因此可以通过检测人血清中CETN2和POFUT1自身抗体的表达水平判断患早期ESCC及癌前病变的风险。
[0008]本专利技术还提供了一种血清CETN2和POFUT1自身抗体定量检测方法，检测方法所需试剂盒包括固相载体、包被于固相载体上的重组CETN2抗原蛋白、酶标二抗、标准品、显色底物、洗涤液和反应终止液。
[0009]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0010]ESCC肿瘤血清自身抗体标志物的发现：基于血清蛋白质组学(SERPA)和纳米液相色谱结合四极杆飞行时间串联质谱(Nano
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LC
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Q
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TOF
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MS/MS)，对10例早期ESCC患者血清和10例健康对照(HC)组血清中差异出现的自身抗体蛋白进行了筛选及鉴定，发现在早期ESCC患者血清中存在高水平的CETN2和POFUT1特异性自身抗体。
[0011]CETN2和POFUT1自身抗体的临床诊断效果验证：收集376例患者及健康对照为临床队列、对队列中所有参与者血清进行两种自身抗体表达水平检测。结果表明CETN2和POFUT1自身抗体筛选早期ESCC及HGIN患者具有临床诊断价值。
[0012]根据本专利技术的具体实施方式，所述重组CETN2抗原蛋白为带有His标签的CETN2全长融合蛋白(基因ID：1069)。该融合蛋白是利用DNA体外重组技术，将His标签与CETN2蛋白一起融合表达得到的。通过带有His标签，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述重组POFUT1抗原蛋白为商品化蛋白，蛋白品牌及货号为：中国台湾Abnova公司，H00023509
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P01。
[0013]根据本专利技术的具体实施方式，所述重组CETN2和POFUT1抗原蛋白的包被浓度分别为4μg/mL和2μg/mL。
[0014]进一步的，所述酶标抗体为本领域常用的可用于检测的辣根过氧化物酶标记抗体，包括但不限于辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体。
[0015]上述血清CETN2和POFUT1自身抗体定量检测方法用于早期ESCC患者筛查及诊断产品中的应用，以及用于HGIN患者筛查及诊断产品中的应用也属于本专利技术的保护范畴。
[0016]本文中“CETN2和POFUT1自身抗体”，指的是“CETN2蛋白自身抗体和POFUT1蛋白自身抗体”。
[0017]本专利技术检测试剂盒采用酶联免疫法测定，抗体检测反应板为包被有重组CETN2和POFUT1抗原蛋白的固相载体，例如包被有重组CETN2抗原蛋白的酶标板，待测血清或标准品中的特异性CETN2自身抗体能够与酶标板微孔中的CETN2蛋白特异性结合而吸附于微孔内，加入酶标二抗孵育，充分洗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CETN2和POFUT1自身抗体作为食管鳞癌筛查的血清标志物的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的CETN2和POFUT1自身抗体水平在食管鳞癌患者血清中高于健康对照组血清。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的CETN2和POFUT1自身抗体在早期食管鳞癌及癌前病变患者的筛查和早期诊断中具有较高价值。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测CETN2和POFUT1自身抗体的试剂分别为酶联免疫法、胶体金免疫层析、液相芯片检测用试剂。5.一种血清CETN2和POFUT1自身抗体定量ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体、包被于固相载体上的重组抗原蛋白、酶标二抗、标准品、显色底物、洗涤液和反应终止液；所述重组CETN2和POFUT1抗原蛋白的包被浓度分别为4μg/mL和2μg/mL；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体。6.一种用于检测血清CETN2 IgG抗体和IgM抗体的胶体金检测试纸条，其特征在于，包括盒座、盒盖和胶体金试纸条，所述试剂条玻璃纤维垫片上包括包被有胶体金标记的CETN2抗原及鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜片上设有平行的检测线和质控线，检...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄坚，陈质斌，何萍萍，朱倩钰，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：