用于生产白藜芦醇的复合酶、工程菌株、生物材料及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于生产白藜芦醇的复合酶，属于基因工程技术领域。包括：约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL，拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4

【技术实现步骤摘要】
用于生产白藜芦醇的复合酶、工程菌株、生物材料及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种用于生产白藜芦醇的复合酶、工程菌株、生物材料、生产方法及在生产白藜芦醇中的应用。

技术介绍

[0002]白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种存在多种植物中的具有二苯乙烯结构的非黄酮类天然多酚物质，是植物在逆境刺激如紫外线、真菌感染、损伤等胁迫或非胁迫条件下产的植物次生代谢产物。目前，在葡萄科、豆科的落花生属、决明属、虎杖、何首乌、松树和桑葚等21科、31属的72种植物中发现白藜芦醇，其在虎杖中最高含量仅为0.2％。研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎、心血管保护、调剂血脂和治疗糖尿病等诸多生理药理作用。
[0003]现阶段市场上的白藜芦醇的供应主要依赖植物提取，然而提取工艺的复杂及在植物组织中极低的含量，使其工艺产量及产率极低。而化学合成因其工程繁琐，无法满足绿色生产的要求。随着合成生物学的日益发展，越来越多的天然产物实现了在微生物中的生产及合成。因此，利用微生物作为细胞工厂生产白藜芦醇成为一种新选择。
[0004]目前已报道的以酵母菌为底盘进行白藜芦醇的合成主要有两条途径。其一是以苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia
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lyase，PAL)的作用下生成反式肉桂酸，然后在肉桂酸4
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羟基化酶(cinnamate
‑4‑
hydroxylase，C4H)作用下形成香豆酸源。接着香豆酸经由4r/>‑
香豆酰辅酶A连接酶(4
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coumarate：coenzyme Aligase，4CL)转化为香豆酸酰辅酶A，最后一分子香豆酸酰辅酶A在白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase，RS)的催化下，结合3分子的丙二酰辅酶A生成白藜芦醇；其二是胞内的酪氨酸在酪氨酸氨裂解酶(tyrosine ammonialyase，TAL)的作用下形成香豆酸，之后经由4CL和RS催化形成白藜芦醇。由此可见，无论是以苯丙氨酸或是酪氨酸为底物，形成白藜芦醇的过程中均需要4CL和RS两个酶的参与。而目前虽可经过一系列的代谢途径优化，提高目标产物的代谢通量，然而现有阶段的白藜芦醇产量仍无法满足工业化生产需求。
[0005]现阶段，白藜芦醇的生产效率低主要原因是其生物合成途径中存在许多限速步骤，而两个关键限速步骤是由4CL和STS催化完成的(如附图1所示)。这两个关键酶活性不高，造成目的产物白藜芦醇在微生物中生产的产量低。因此以微生物为底盘进行白藜芦醇的异源合成的研究热点主要聚焦于从自然环境中挖掘高活性编码的4
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香豆酰辅酶A连接酶和白藜芦醇合酶的基因，或对已有的限速步骤的基因进行改造以提升催化效率以及更换更有利于白藜芦醇的生产底盘等。
[0006]目前，已有来自拟南芥、烟草、欧兰芹等植物的4CL基因和来自葡萄、虎杖、花生等来源的STS基因被挖掘出来用于白藜芦醇合成途径的构建。然而目前使用最广泛及效果最好的则是来自拟南芥的At4CL及葡萄的VvSTS组合。例如，专利CN114317306A在Rhodotorula属酵母整合了来自拟南芥的At4CL和酿酒葡萄的VvSTS进行白藜芦醇的生产。专利CN108117588A中针对拟南芥来源的At4CL基因进行易错PCR使之产生突变，从而获得了催化
活性提升的突变体。专利CN106032525A、CN110628657A、CN111733179A和CN114317306A分别采用大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、和圆红冬孢酵母用作白藜芦醇的生产底盘。
[0007]然而，从目前的专利和生产情况看，前体供应和关键酶4CL和STS酶活性不高仍是制约以微生物底盘的白藜芦醇的生产的瓶颈所在。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于，设计能够提高白藜芦醇产量的融合蛋白策略，构建能够高效表达采用微生物合成白藜芦醇的合成路径中的关键酶的表达载体，减轻目标途径对工程菌的代谢压力，制备获得能够高量生产白藜芦醇的工程菌株。
[0009]一方面，本申请提供了一种用于生产白藜芦醇的复合酶，其包括约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL、拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4
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香豆酰辅酶A连接酶At4CL、虎杖(Polygonumcuspidatum)来源的白藜芦醇合成酶PcSTS和/或拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的丙二酰辅酶A合酶AtAAE13。
[0010]在一种实施方式中，所述复合酶包括上述酶中的任意两种；优选的，至少包括FjTAL、At4CL、PcSTS中的任意一种和AtAAE13；更优选的，所述复合酶包括FjTAL、At4CL、PcSTS和AtAAE13。
[0011]在一种实施方式中，约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或与SEQ ID NO.2具有至少90％序列同一性；
[0012]拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4
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香豆酰辅酶A连接酶At4CL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或与SEQ ID NO.6具有至少90％序列同一性；
[0013]虎杖(Polygonum cuspidatum)来源的白藜芦醇合成酶PcSTS，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与SEQ ID NO.14具有至少90％序列同一性；
[0014]拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的丙二酰辅酶A合酶AtAAE13，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或与SEQ ID NO.20具有至少90％序列同一性。
[0015]另一方面，本申请提供了一种生产白藜芦醇的工程菌株，所述工程菌株表达的酶包括：
[0016]约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或与SEQ ID NO.2具有至少90％序列同一性；
[0017]拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4
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香豆酰辅酶A连接酶At4CL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或与SEQ ID NO.6具有至少90％序列同一性；
[0018]虎杖(Polygonum cuspidatum)来源的白藜芦醇合成酶PcSTS，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与SEQ ID NO.14具有至少90％序列同一性。
[0019]可选的，上述酶的氨基酸序列均还可以与对应所示序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的序列同一性。
[0020本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于生产白藜芦醇的复合酶，其包括约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL、拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4
‑
香豆酰辅酶A连接酶At4CL、虎杖(Polygonum cuspidatum)来源的白藜芦醇合成酶PcSTS和/或拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的丙二酰辅酶A合酶AtAAE13。2.根据权利要求1所述的复合酶，其特征在于，约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或与SEQ ID NO.2具有至少90％序列同一性；拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4
‑
香豆酰辅酶A连接酶At4CL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或与SEQ ID NO.6具有至少90％序列同一性；虎杖(Polygonum cuspidatum)来源的白藜芦醇合成酶PcSTS，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与SEQ ID NO.14具有至少90％序列同一性；拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的丙二酰辅酶A合酶AtAAE13，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或与SEQ ID NO.20具有至少90％序列同一性。3.一种生产白藜芦醇的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株表达的酶包括：约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或与SEQ ID NO.2具有至少90％序列同一性；拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4
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香豆酰辅酶A连接酶At4CL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或与SEQ ID NO.6具有至少90％序列同一性；虎杖(Polygonum cuspidatum)来源的白藜芦醇合成酶PcSTS，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与SEQ ID NO.14具有至少90％序列同一性。4.根据权利要求3所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株表达的酶还包括，拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的丙二酰辅酶A合酶AtAAE13，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或与SEQ ID NO.20具有至少90％序列同一性；或亚麻(Camelina sativa)来源的丙二酰辅酶A合酶CsAAE，其氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示或与SEQ ID NO.22具有至少90％序列同一性。5.根据权利要求4所述的工程菌株，其特征在于，所述约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸氨裂解酶FjTAL，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1具有至少90％序列同一性；所述拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的4
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香豆酰辅酶A连接酶At4CL，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或与SEQ ID NO.5具有至少90％序列同一性；所述虎杖(Polygo...

【专利技术属性】
技术研发人员：王会艳，刘腾飞，陈彤彤，张晓芬，陶文文，王瑞妍，
申请(专利权)人：北京华熙荣熙生物技术研究有限公司，
类型：发明
国别省市：