具有抗菌活性的细胞壁降解酶制造技术

本发明专利技术涉及一系列有效控制金黄色葡萄球菌的具有抗菌活性的细胞壁降解酶，其中本发明专利技术的具有抗菌活性的细胞壁降解酶是一系列具有新的氨基酸序列的裂解酶。本发明专利技术的具有抗菌活性的细胞壁降解酶可被用作能够有效抑制金黄色葡萄球菌，可应用于环境中金黄色葡萄球菌的消杀及由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病的治疗等。疗等。

【技术实现步骤摘要】
具有抗菌活性的细胞壁降解酶


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一系列有效控制金黄色葡萄球菌的细胞壁降解酶，包括其自身的应用，以及生产方法。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌是人类最重要的病原体之一，可引起多种疾病，如：皮肤、软组织、伤口、骨骼和血液感染、中毒性休克综合征和食物中毒等。[McCaig LF等Emerg Infect Dis 2006;12:1715
–
1723.Laureano AC等Clin Dermatol 2014;32:711
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714.Br
ü
ssow H Environ Microbiol 2016;18:2089
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2102.]。它是医院感染的最常见原因之一，这种细菌已经成为医院的严重威胁。此外，在临床环境中抗生素耐药性细菌的出现和增加令人担忧，尤其是甲氧西林耐药性细菌。世界卫生组织最近的数据表明，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株造成了世卫组织区域所有感染病例的20%以上，但在一些国家，这一比例达到80% (WHO. 2014. Antimicrobial resistance,global report on surveillance 2014.WHO,Geneva, Switzerland)；此外,金黄色葡萄球菌是食源性疾病的主要病原体之一,在人类体内产生肠毒素(Le Loir Y等. 2003. Genet Mol Res 2:63
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76.)。2014年,欧盟食物传染大爆发，有7.5%的食品是被金黄色葡萄球菌污染的(EFSA, ECDC. 2016. The European Union summary report on trends andsources of zoonoses, zoonotic agents and food
‑
borne outbreaks in 2014.EFSA J 13:4329.)。同样，在动物养殖过程中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染是个常见的问题,因为牲畜不仅可以感染细菌还可以传播细菌(NormannoG等.2015.Food Microbiol 51:51
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56.)。众所周知,在食品、动物养殖等领域抗生素的滥用增加耐多药细菌(MDR)的产生导致当前的全球健康危机。为了应对这个问题,一些国家已限制在畜牧业中使用抗生素(Maron DF,等.2013.Global Health 9:48.)。
[0003]随着对经典抗生素的耐药性迅速出现，迫切需要替代治疗方案。为了克服这一问题，近年来噬菌体和从噬菌体中提取的胞壁裂解酶成为了一种替代方法。
[0004]噬菌体是一种病毒，在它们的生命周期中只感染细菌。在大多数情况下，溶菌生命周期随着细菌细胞的死亡而结束，从而使噬菌体成为细菌的自然杀手。裂解可以通过两种机制进行：一是具有单链基因组的噬菌体编码抑制细菌肽聚糖生物合成的裂解因子；二是在双链DNA (dsDNA)噬菌体中，噬菌体后代的释放是由两种蛋白质holin和endolysin介导的，分别负责细胞膜破裂，一旦病毒粒子在细菌细胞内成熟，中空蛋白holin在细胞内膜上形成孔，允许内溶素endolysin进入细胞壁。随后,endolysin降解肽聚糖使细胞渗透溶解。此外,噬菌体感染革兰氏阴性菌宿主时需提供额外的蛋白质，称为跨膜蛋白，帮助打破革兰氏阴性宿主细胞外膜。(Catalao MJ等2013.FEMS MicrobiolRev 37:554
ꢀ–
571)另外病毒粒子相关肽聚糖水解酶(VAPGHs)是病毒粒子的结构成分，通过轻微降解肽聚糖参与感染的初始步骤，使噬菌体遗传物质进入细菌细胞；也有研究人员称其为噬菌体病毒粒子尾部相关的胞壁降解酶TAME（Paul VD,等2011;11: 226.），认为所有形态的噬
菌体颗粒各自含有与尾部结构相关的TAME，使细胞壁局部降解有利于噬菌体DNA的注入。
[0005]革兰氏阳性dsDNA噬菌体编码的裂解蛋白(endolysin和VAPGHs)表现出共同特征，都具有模块化结构，该模块化结构由不同的功能域组成。一方面，这种结构赋予了裂解蛋白显著的底物特异性；另一方面，这种模块化结构方便在原有基础上设计新的具有增强抗菌活性的蛋白(Oliveira H等. 2013.J Virol 87:4558
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4570.)。大多数葡萄球菌噬菌体内溶酶endolysin具有一个或两个N端催化结构域和一个C端细胞壁结合结构域(CBD)；类似的模块结构VAPGHs同样由一个或两个催化结构域组成，但缺少CBD结构域；而且在葡萄球菌噬菌体内溶酶endolysin中没有发现信号肽或跨膜结构域。(Rodr
í
guez
‑
Rubio L等.2013.Crit Rev Microbiol 39:427
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434.)。
[0006]为了了解噬菌体裂解蛋白的催化机理，研究目标细菌肽聚糖的结构尤为重要。Vollmer W等研究人员指出肽聚糖由短肽交联的线性聚糖链组成，这些聚糖链由交替的n
ꢀ‑
乙酰氨基葡萄糖(GIcNAc)和n
ꢀ‑
乙酰胞壁酸(MurNAc)残基组成，β
‑
1,4糖苷键连接。在金黄色葡萄球菌中，每个MurNAc残基的D
‑
乳酰基被肽茎取代，肽茎的组成为L
‑
Ala
‑
Glu
‑
Lys
‑
D
‑
Ala。(Vollmer W等.2008.FEMS Microbiol Rev 32:259
ꢀ–
286.)。研究人员根据噬菌体裂解蛋白催化活性位点不同将其分为:N
‑
乙酰胞壁质酶(N
‑
acetylmuramidase)，又称溶菌酶和胞壁质酶（lysozymes or muramidases)； 内切
‑
β
‑
N
‑
乙酰葡糖胺糖苷酶（endo
‑
b
‑
N
‑
acetylglucosaminidases），又称葡糖胺糖苷酶 (glucosaminidases)；N
‑
乙酰胞壁酰
‑
L
‑
丙氨酸酰胺酶(N
‑
acetylmuraxnyl
‑
L
‑
alanine amidase)；转糖苷酶（transglycosylases）和内肽酶(endopeptidase)，其中内肽酶又分为L
‑
丙氨酰
‑
D
‑
谷氨酸内肽酶, 间
‑
肽桥特异内肽酶。葡糖胺糖苷酶、溶菌酶和转糖苷酶作用于糖链部分，而内肽酶负责切断肽桥，酰胺酶降解糖与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抗菌活性的细胞壁降解酶，其特征在于，由肽聚糖裂解酶或其溶胞壁结构域与细胞壁结合结构域融合得到，其中所述肽聚糖裂解酶的氨基酸序列如下SEQ ID NO:1所示，其溶胞壁结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示、或者在SEQ ID NO:1的基础上进行组合突变A36V，G66S，P88N，Q89A和A129Q，或者在SEQ ID NO:1的基础上进行组合突变R69K，P88N，Q89A，Y113W和A129Q，或者在SEQ ID NO:1的基础上进行组合突变A36V，R69K，A76S，I79V，P88A和Y113W，或者在SEQ ID NO:5的基础上进行V36N单点突变。2.如权利要求1所述的具有抗菌活性的细胞壁降解酶，其特征在于，所述细胞壁结合结构域来自是内溶酶的C端细胞壁结合结构域，更优选地其来自葡萄球菌噬菌体，更优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。3.如权利要求2所述的具有抗菌活性的细胞壁降解酶，其特征在于，其氨基酸分别SEQ ID N0....

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓立，李瑞琦，张晓云，何寅娣，杨赛，李华珍，章家泉，
申请(专利权)人：百葵锐深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：