一种具有杀松材线虫活性的秦皮提取物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种具有杀松材线虫活性的秦皮提取物的制备方法及其应用，将秦皮干粉经乙醇浸提获得提取液，减压蒸馏后得到的乙醇提取物再经乙酸乙酯

【技术实现步骤摘要】
一种具有杀松材线虫活性的秦皮提取物的制备方法及其应用

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[0001]本专利技术属于林业病虫害防治
，涉及一种具有杀灭松材线虫活性的秦皮提取物制备方法及其应用。

技术介绍
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[0002]松材线虫病(又称松树萎蔫病)是一种松树的毁灭性疾病，传染性强、传播速度快、致死率高，对世界多地特别是东亚和欧洲的松树资源造成了严重破坏。20世纪80年代松材线虫病于我国江苏省南京市首次发现，迅速蔓延，目前我国已有19个省(区、市)发现疫情，感染面积超过2000万亩。松材线虫是松材线虫病的主要致病原，主要借助松墨天牛等媒介昆虫传播。目前，防治松材线虫的方法主要有三类：物理防治、化学防治、生物防治。化学防治是防治松材线虫最直接、有效的途径，但常规的合成杀线药剂存在靶点单一、耐药性、威胁非靶标有益生物、破坏生态环境等缺陷，因此，绿色环保的杀线药物的研发日趋热门。自然界植物资源丰富，其中蕴含丰富的活性成分，从植物次生代谢产物中提取具有杀松材线虫活性的物质开发相应药物备受该领域研发人员的关注。
[0003]秦皮是一种由木犀科植物苦枥白蜡树、白蜡树、尖叶白蜡树或宿柱白蜡树的干燥枝皮或干皮经炮制晒干后制成的中药材，生长于辽宁、吉林、河北、河南、内蒙古、陕西、山西、四川等地，分布广泛，取材便捷，具有止泻消炎、抗肿瘤、抗高尿酸血症、抗氧化和抗菌等生物活性。
[0004]本专利技术首次公布了秦皮提取物在杀灭松材线虫中的应用，以期为新型天然植物源松材线虫防治药物的开发提供一定依据。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有杀灭松材线虫活性的秦皮提取物制备方法及其应用，经验证秦皮提取物具有很强的杀松材线虫的活性，其中主要的杀松材线虫活性成分确定，可为开发环境友好的植物源杀松材线虫药剂或仿生合成活性更优越的植物源衍生杀线剂提供化学结构模型。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种具有杀灭松材线虫活性的秦皮提取物在杀灭松材线虫中的应用，所述秦皮提取物是以秦皮干粉为原料，经乙醇浸提、减压蒸馏、乙酸乙酯
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水分液萃取等手段获得的具有强杀松材线虫活性的秦皮乙酸乙酯萃取物，在1mg/mL浓度下在72h对松材线虫的校正死亡率高达94.14％；从中分离得到的秦皮素具有强杀松材线虫活性。
[0007]本专利技术还提供秦皮素在杀灭松材线虫中的应用，其对松材线虫的半数致死率浓度为30.37μg/mL；秦皮素在浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL及200μg/mL时对松材线虫72小时的校正死亡率依次为71.22％、80.48％、92.13％、97.26％；秦皮素可以从秦皮提取物中利用硅胶柱层析进行成分分离得到，也可以从市场购得，或从其他含秦皮素的植物中提取得到。
[0008]本专利技术还提供一种具有杀松材线虫活性的秦皮提取物制备方法，具体操作步骤如下：
[0009]第一步，将市售秦皮干粉与无水乙醇以料液比为200g:1L的比例混合，室温下超声波辅助震荡6h，浸提液经布氏漏斗减压抽滤后获得秦皮乙醇初提液，滤渣按上述方法重复浸提并减压抽滤，合并浸提液，得到秦皮乙醇提取液；
[0010]第二步，将秦皮乙醇提取液采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，得棕色油状秦皮乙醇初提物；
[0011]第三步，乙醇初提物经体积比为1：1的乙酸乙酯
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水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压蒸馏浓缩，获得秦皮乙酸乙酯萃取物。
[0012]取以上所得秦皮乙酸乙酯萃取物适量，溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成20mg/mL的测试母液。取5μL测试母液加入96孔板，再加入95μL含有约100条松材线虫的0.5％ Triton X
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100水溶液中，充分混匀。以含0.5％ Triton X
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100的5％ DMSO水溶液作为阴性对照，每个处理组重复3次，将孔板置于25℃的培养箱中暗培养。在72h内每隔24h取出孔板置于立体显微镜下观察并记录线虫的存活状态，线虫僵直并以解剖针触动无反应确定为死亡状态。根据如下公式计算各处理线虫的校正死亡率：
[0013][0014]结果显示，秦皮乙酸乙酯萃取物72h在1mg/mL浓度下对松材线虫的校正死亡率为94.14％，具有显著杀松材线虫活性。
[0015]将秦皮乙酸乙酯提取物利用硅胶(200
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300目)柱层析进行成分分离，以正己烷
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乙酸乙酯
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甲醇溶剂体系梯度洗脱，洗脱组分通过硅胶(GF
254
)薄层层析对比分析，相同组分合并后浓缩，共获得7个组分：Fr.1
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Fr.7。经杀松材线虫活性测试Fr.6具有较强杀松材线虫活性。对该组分采用硅胶(200
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300目)柱层析以乙酸乙酯
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甲醇(4:1，v/v)作为洗脱剂进一步分离纯化，得化合物秦皮素。秦皮素的化学结构式为：
[0016][0017]秦皮素的特征常数为：无色至灰白色结晶性粉末，EIMS(m/z):208[M
·
]+
；1H NMR(600MHz,DMSO
‑
d6):δ7.84(1H,d,J＝9.48Hz,H
‑
4),δ6.75(1H,s,H
‑
5),δ6.17(1H,d,J＝9.48Hz,H
‑
3),δ3.77(3H,s,OCH3)；
13
C NMR(DMSO
‑
d6):δ161.06(C
‑
2),δ145.86(C
‑
6),145.59(C
‑
4),δ139.89(C
‑
7),139.80(C
‑
9),133.38(C
‑
8),δ123.39(C
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3),112.36(C
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3),δ110.76(C
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10),δ100.83(C
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5),δ56.57(OCH3)。
[0018]将秦皮素溶于DMSO，配成一系列浓度(1
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4mg/mL)的母液作为测试溶液，然后按照以上秦皮提取物的杀松材线虫活性测试方法进行活性测试，获得各试液对松材线虫72小时的校正死亡率，通过SPSS 25.0数据处理软件进行统计分析，结果显示秦皮素在72h时对松材线虫的半数致死率浓度为30.37μg/mL。
[0019]本专利技术与现有技术相比，首次将秦皮提取物用于杀灭松材线虫，开发了秦皮提取
物的新用途，而且提供了有效的植物源杀松材线虫活性物质，原料来源便捷，提取方法简便，成本低廉，秦皮提取物在控制松材线虫病方面具有开发潜力，应用于开发环境友好的植物源杀松材线虫药剂。
具体实施方式：
[0020]下面通过具体实施例对本专利技术作进一步阐述。
[0021]实施例1
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有杀松材线虫活性的秦皮提取物在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于，所述秦皮提取物在1mg/mL浓度下72h后对松材线虫的校正死亡率为94.14％。2.秦皮素在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于，秦皮素具有强杀松材线虫活性，其对松材线虫的半数致死率浓度为30.37μg/mL。3.根据权利要求2所述的秦皮素在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于，所述秦皮素在200μg/mL浓度下72h后对松材线虫的校正死亡率为97.26％。4.一种具有杀松材线虫活性的秦皮提取物制备方法，其特征在于，以秦皮干粉为原料...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭群群，李春涵，冯家乐，李荣贵，杜桂彩，王超，杨宏，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：