一种pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧的制备方法及应用，可有效解决现有技术不能响应pH聚集DR5同时促进DR5表达的问题，其解决的技术方案是，该DNA纳米弹簧包含DR5TP、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶；将不同DNA链进行退火杂交和T4 DNA连接酶连接，合成编码有i

【技术实现步骤摘要】
一种pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧的制备方法及应用
一、

[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别是一种pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧的制备方法及应用。
二、
技术介绍

[0002]近年来，细胞凋亡是癌症治疗的研究重点。肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员可以被特异性地激活以诱导癌细胞凋亡或调节免疫细胞的增殖和激活。尽管肿瘤坏死因子受体和相对应的配体的结构信息已经很清楚，但仍缺乏有效触发肿瘤坏死因子受体信号的分子工具或药物。典型的例子是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)。体内天然TRAIL是三聚体结构，可以识别和激活肿瘤坏死因子受体超家族中的死亡受体5(DR5)，三聚化DR5诱导肿瘤细胞产生死亡诱导信号级联(DISC)，从而激活半胱氨酸蛋白酶8(capase8)，通过内源性和外源性两种途径导致细胞凋亡。基于TRAIL独特的抗肿瘤活性，TRAIL重组蛋白、DR4/5激动型单抗或死亡受体5靶向多肽(DR5TP)一直作为抗癌药物进行研究试验。但是试验治疗效果不理想，一些挑战限制了它们的应用。比如，DR5聚集不足和肿瘤细胞对配体
‑
DR5诱导的肿瘤细胞凋亡的抵抗。
[0003]有研究表明DR5的跨膜结构域通过聚集形成更高级的结构，只有DR5形成三聚体才会激活产生凋亡信号，DR5聚集不足则无法触发信号。针对这一点，有报道开发氧化石墨烯纳米支架、葡聚糖支架分别共价多聚TRAIL重组蛋白和DR5TP，利用聚类DR5以有效激活肿瘤细胞DR5受体，诱导细胞凋亡。然而，这两种支架不能精确地控制蛋白质的纳米尺度空间呈现，以及有限的空间不允许更高的蛋白结合密度，这极大限制了DR5激活。此外，肿瘤细胞通过下调DR5表达来抵抗配体
‑
DR5结合引起的细胞凋亡，也会抑制治疗效果。
[0004]众所周知，区别于正常组织，肿瘤组织的微环境特征之一是低pH。响应肿瘤微环境释放药物能减少药物对正常组织的毒性，提高治疗效果。DNA纳米材料具有良好生物相容性、生物可降解性、可编程性以及刺激响应性，是构建载体的理想材料。有工作表明，编码有i
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基序(i
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motif)的DNA水凝胶能够响应肿瘤微酸环境而发生凝胶
‑
溶胶的转变以释放包裹的药物。但是，如何能响应pH聚集DR5同时促进DR5表达至今未见有公开报道。
三、
技术实现思路

[0005]针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧的制备方法及应用，可有效解决现有技术不能响应pH聚集DR5同时促进DR5表达的问题。
[0006]本专利技术解决的技术方案是，该DNA纳米弹簧包含DR5TP(死亡受体5靶向多肽)、葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)；将不同DNA链进行退火杂交和T4 DNA连接酶连接，合成编码有i
‑
motif(i
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基序)的DNA纳米弹簧，通过生物素
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链霉亲和素相互结合作用修饰DR5TP、GOX和HRP，得到pH响应聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧，具体包括以下步
NO:4所示。
[0022]所述的步骤3)中，cDNA序列为：GGGGGGGGAAAGGGGGGGG，如SEQ ID NO:5所示。
[0023]所述的步骤5)中，DNA短链1序列为：TTTTTTTTTTAAAAAAAAAACGTCTGTATA，如SEQ ID NO:6所示。
[0024]所述的步骤5)中，DNA短链2序列为：GTCAGGATCGAAAAAAAAAATTTTTTTTTT，如SEQ ID NO:7所示。
[0025]所述的pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧具有长线性结构，长度可达微米。
[0026]所述的pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧在诱导特异性调节肿瘤细胞凋亡药物中的应用。
[0027]所述的肿瘤为乳腺癌和结直肠癌。
[0028]本专利技术制备方法简单，操作简单且合成迅速，基于pH响应核酸自递送策略，通过调控配体间距诱导肿瘤细胞凋亡信号激活，通过响应肿瘤微酸环境收缩，实现DR5受体的有效激活，并且巧妙联合酶级联反应促进细胞凋亡，适用于各种不同的肿瘤疾病，如乳腺癌、结直肠癌、白血病等，适用面广，是DNA纳米材料上的创新。
四、附图说明
[0029]图1为本专利技术制备pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧的原理示意图。
[0030]图2为本专利技术天然聚丙烯酰胺凝胶电泳表征iDNS合成图。
[0031]图3为本专利技术天然聚丙烯酰胺凝胶电泳和原子力表征iDNS
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D图。
[0032]图4为本专利技术磁珠实验表征iDNS
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GH图。
[0033]图5为本专利技术微孔板分光光度计分析iDNS
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D
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GH酶级联反应图。
[0034]图6为本专利技术荧光分析iDNS响应微酸环境可逆收缩图。
[0035]图7为本专利技术iDNS
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D靶向乳腺癌细胞的激光共聚焦成像图。
[0036]图8为本专利技术iDNS
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D响应肿瘤微酸环境在乳腺癌细胞膜表面收缩的激光共聚焦成像图。
[0037]图9为本专利技术MTT法检测细胞活力图。
五、具体实施方式
[0038]以下结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0039]实施例1
[0040]本专利技术在具体实施时，如图1所示，具体包括以下步骤：
[0041]1)成环反应
[0042]5’
磷酸化的线性DNA链L1和连接primer按照比例1：4分别加入到4μL 10
×
T4 DNA ligase buffer和体积0μL～36μL的超纯水混合溶液中，用移液枪吹打混匀，95℃加热5min使DNA链变性，然后25℃孵育1h使L1与连接primer杂交，然后向混合溶液中加入2μL T4 DNA ligase(5U/μL)，25℃下孵育3h，成环反应结束后，向混合溶液中分别加入1μL Exo I(20U/μL)和Exo III(200U/μL)，经过37℃40min孵育以剪切primer，然后80℃20min以灭活酶，得到
单独的C1环；
[0043]2)合成DNA纳米弹簧混合溶液
[0044]将步骤1)得到的C1环(1μM)、5
’
磷酸化的线性DNA链L2(10μM)、5
’
磷酸化的线性DNA链L3(10μM)按照比例按照比例1：4：4、1：10：10和1：20：20分别加入到4μL10
×
T4 DNA ligase buffer和体积0μL～36μL的超纯水混合溶液中，用移液枪吹打混匀，90℃加热10min然后冷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pH驱动聚集死亡受体5联合酶级联的DNA纳米弹簧的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）成环反应5
’
磷酸化的线性DNA链L1和连接primer按照比例1：4分别加入到4μL10
×
T4DNAligasebuffer和体积0μL~36μL的超纯水混合溶液中，用移液枪吹打混匀，95℃加热5min使DNA链变性，然后25℃孵育1h使L1与连接primer杂交，然后向混合溶液中加入2μLT4DNAligase，25℃下孵育3h，成环反应结束后，向混合溶液中分别加入1μLExoI和ExoIII，经过37℃40min孵育以剪切primer，然后80℃20min以灭活酶，得到单独的C1环；2）合成DNA纳米弹簧混合溶液将步骤1）得到的C1环、5
’
磷酸化的线性DNA链L2、5
’
磷酸化的线性DNA链L3按照比例1：4：4、1：10：10和1：20：20分别加入到4μL10
×
T4DNAligasebuffer和体积0μL~36μL的超纯水混合溶液中，用移液枪吹打混匀，90℃加热10min然后冷却到50℃孵育30min，然后混合溶液快速降温到25℃，加入2μLT4DNAligase，25℃孵育1h，然后65℃加热10min以灭活酶，得合成DNA纳米弹簧混合溶液；3）添加互补序列将与i
‑
motif互补的DNA序列cDNA95℃加热5min，然后快速加入到合成DNA纳米弹簧混合溶液中，使其终浓度是4μM，得合成编码有i
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motif的DNA纳米弹簧；4）连接DR5TPDR5TP
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biotin和链霉亲和素按照2：1的比例分别加到体积0μL~100μL的PBS缓冲液中，移液枪吹打混匀后室温下孵育30min，然后按照链霉亲和素和步骤3）得到的合成编码有i
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motif的DNA纳米弹簧1：1的比例混合后室温下孵育30min，编码有i
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motif的DNA纳米弹簧即可成功连接DR5TP，得合成修饰有DR5TP的DNA纳米弹簧；5）修饰GOX和HRPGOX
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biotin、HRP
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biotin分别和链霉亲和素按照2：1的比例分别加到体积0μL~100μL的PBS缓冲液中，移液枪吹打混匀后室温下孵育30min，然后按照GOX
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链霉亲和素和DNA短链11：1的比例混合后室温下孵育30min；HRP
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链霉亲和素和DNA短链21：1的比例混合后室温下孵育30min，即可得到连接酶的核酸链GOX
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【专利技术属性】
技术研发人员：张开翔，王丹钰，段捷，高华，史进进，刘军杰，张振中，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：