一种用于单细胞新生RNA标记和测序的方法技术

提供了一种用于标记大规模新生单细胞mRNA的测序方法，包括用于标记大规模新生单细胞mRNA(Dynamic

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种用于单细胞新生RNA标记和测序的方法


[0001]本公开涉及RNA代谢标志物的测序领域，特别是涉及适用于单细胞测序的Dynamic
‑
seq技术和大规模标记细胞中的新mRNA。

技术介绍

[0002]在mRNA被完全加工并输出到细胞质后，转录物的寿命会影响其对基因表达的贡献。事实上，据认为mRNA的稳定性对整体基因调控有20
‑
50％的贡献
[1
‑
3]。mRNA降解是受顺式和反式作用因子二者影响的高度调控过程
[4
‑
5]。准确且可重现的mRNA衰减率测量对于阐明这种因素网络如何影响RNA稳定性至关重要。
[0003]在多个阶段调节基因表达，包括新生转录物的转录和加工，翻译效率和细胞内定位的调节以及RNA降解速率的控制。RNA生物学中的许多问题涉及RNA丰度的动力学以及各种参与者对RNA合成和降解的影响，而不仅是RNA的稳态丰度。从RNA
‑
seq方法获得的RNA丰度的稳态测量无法将转录的影响与任何给定转录物总丰度中的RNA降解的影响分开，而是仅提供了有关转录物(假定的稳态)丰度的信息
[6]。
[0004]随着RNA
‑
seq技术的快速发展，单细胞RNA
‑
seq(scRNA
‑
seq)也应运而生，并取代了传统的单细胞微阵列
[7]。且scRNA
‑
seq完成了单细胞分辨率的基因表达谱
[8r/>‑
9]。凭借这些独特的功能，scRNA
‑
seq已被用于剖析细胞分化的分子过程和追踪发育中的细胞谱系。它还用于分析疾病病变中的细胞，以确定与损伤有关的细胞类型和分子动力学
[10]。
[0005]高通量RNA测序(RNA
‑
seq)和代谢标志物的组合已成为研究RNA的重要手段，有助于确定各种条件下细胞中RNA合成和降解的相关参数，以了解mRNA稳定性与基因表达之间的关系。最广泛使用的方法涉及用硫醇标记的核苷类似物如S4U(S4U标记)进行代谢标记
[10]。代谢标记是有用的工具，可以在不干扰RNA转录或加工的情况下了解RNA动力学。4
‑
硫尿苷(S4U)是一种方便的代谢标记核苷，因为它是细胞渗透性的，掺入新转录的RNA
[11]中。
[0006]目前，S4U代谢标志物技术已发展成为多种RNA代谢标志物测序技术，从而促进了细胞转录的实时观察，如SLAM
‑
seq、NASC
‑
seq和TimeLapse
‑
seq
[12
‑
14]。SLAM
‑
seq是用于RNA代谢标记的最广泛使用的转录组技术。该方法使用伯硫醇反应性化合物碘乙酰胺(IAA)，它通过亲核取代将羧基酰胺甲基共价连接到S4U上。在RNA
‑
seq数据中观察到的将S4U残基化学转化为胞嘧啶类似物的点突变(T到C转换)。SLAM
‑
seq组合了代谢RNA标记技术和高通量RNA测序方法，其可以快速获得总RNA中的基因表达动态。时间长度和标记效率均会影响估计的RNA降解的速率。非信息性背景RNA的存在会给测量带来额外的噪音，并浪费测序能力。SLAM
‑
seq广泛应用于批量混合细胞样品，其有助于实时掌握mRNA的变化。然而，S4U标记的RNA无法从单细胞中分离出来进行测序，并且无法比较不同细胞之间的转录活性。然而，目前SLAM
‑
seq在单细胞测序中的应用仅限于小样本量，因此无法比较和分析大量单细胞
[12]。
[0007]scSLAM
‑
seq由维尔茨堡大学开发。该方法将S4U烷基化用于RNA代谢标志物和单细胞转录组测序技术，以通过区分各个细胞中数千个基因的新旧RNA来直接记录转录活性。开发了贝叶斯算法(Grand
‑
SLAM)，用于准确分析新的RNA和降解率，Grand
‑
SLAM 2.0可用于同
步分析数百个单细胞SLAM
‑
seq文库。该方法只能处理数百个单细胞，但不能满足大规模单细胞mRNA代谢标志物转录组测序
[15]。

技术实现思路

[0008]在本公开中，利用Singleron独立开发的SCOPE单细胞测序和RNA代谢标志物技术，我们开发了一种适用于大规模单细胞动态测序的单细胞测序方法(scDynamic
‑
seq)，可以为研究RNA半衰期和稳定性的变化、鉴定由RNA修饰介导的靶基因变化、药物筛选等方面提供新的思路。
附图说明
[0009]图1：本公开的示意图。
[0010]图2：本公开实施方案中大规模单细胞代谢标志物测序的示意图。
具体实施方式
[0011]为了将RNA代谢标志物技术应用于大规模单细胞测序，将S4U代谢标志物与基于微流控芯片的创新SCOPE单细胞测序制备技术相组合。首先用核苷类似物4
‑
硫尿苷(S4U)代谢细胞，以将新合成的RNA与先前存在的RNA分离，然后用碘乙酰胺(IAA)处理以将S4U修饰的U碱基转化为胞嘧啶类似物。在逆转录中，胞嘧啶类似物被误认为是C，导致与cDNA中G而非碱基A错配。测序后，通过分析这些错配的G，可以获得新合成的mRNA的信息(图1)。
[0012]使用GEXSCOPE单细胞RNA
‑
seq文库构建试剂盒(SingleronBiotechnologies)证明该技术的可行性和目前公开的大规模单细胞mRNA代谢标志物转录组测序的有效性。根据制造商的要求进行实验，改动如下。
[0013]简单地说，解离小鼠骨髓的scDynam
‑
seq数据。组织解离后，将细胞在S4U培养基中培养2小时。将单细胞悬浮液加载到芯片上，并将单细胞分到芯片上的单个孔内。制备了两个样品：一个用GEXSCOPE标准方案对单细胞mRNA(“对照”)进行测序，另一个用大规模单细胞mRNA代谢标志物转录组(scDynamic
‑
seq)测序。将先前用PBS处理过的细胞条形码磁珠加载到微芯片，然后洗掉多余的磁珠。各个细胞条形码磁珠均含有寡核苷酸，这些寡核苷酸结合表面上独特的细胞条形码序列。磁珠中的各个寡核苷酸也具有独特的分子标签序列(UMI)。序列中检测到的UMI数量可用于准确定量不同的RNA分子。根据磁珠的直径和孔的直径，微芯片上的各个孔只能有一个磁珠落入其中。将100μl裂解缓冲液放入芯片中，在室温下孵育20分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将200μl 0.02％ SSC
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Tween加至芯片磁铁并洗去裂解缓冲液。然后将芯片放在冰上并注入100μl预冷的IAA试剂。随着时间的推移，将200μl的FC
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于单细胞的新生mRNA的大规模标记的测序方法，包括：标记大规模单细胞的新生mRNA的步骤；以及制备SCOPE单细胞测序文库的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中Dynamic
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seq技术用于标记新生的大规模单细胞的mRNA，其包括以下步骤：a.将细胞短暂暴露于补充有核苷类似物4
‑
硫尿苷(S4U)的培养基中，S4U在转录过程中掺入新的RNA中；b.将细胞和磁珠加载到芯片中，裂解细胞并捕获mRNA；以及c.捕获后，通过IAA处理将S4U修饰的U碱基转化为胞嘧啶类似物。3.根据权利要求2所述的方法，其中以100μM至500μM的浓度使用核苷类似物4
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硫尿苷(S4U)并...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙同同，唐国鑫，李季，孙家孟，
申请(专利权)人：新格元南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：