新冠病毒突变体通用型疫苗cRBD的制备与应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开一种新冠病毒突变体通用型疫苗cRBD的制备与应用，具体的为设计了如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在制备SARS

【技术实现步骤摘要】
新冠病毒突变体通用型疫苗cRBD的制备与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种新冠病毒突变体通用型疫苗cRBD的制备与应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒（SARS
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CoV
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2）在人群中不断传播，导致新的突变株不断出现，突变株在S蛋白特别是RBD（Receptor binding domain）区域的大量突变使得现有疫苗诱发的中和抗体无法进行识别，从而失去保护效力，因此亟待开发能够针对多种突变株产生广谱保护效力的通用型疫苗。现有的技术方案主要有：灭活疫苗，通过将SARS
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CoV
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2病毒灭活后制成疫苗，活毒制备，需重复进行灭活验证，更新代次慢，不具有广谱性，难以应对突变频率较高的病毒；mRNA疫苗，利用病毒蛋白的RNA序列设计制备成RNA制剂，存在副作用大，安全系数较其他疫苗低，需要复杂的递送系统，难以针对新出现的毒株；重组蛋白疫苗，利用表达系统直接表达出病毒蛋白，甚至可设计为多价或多聚体疫苗，可同时预防多个毒株，但多聚体蛋白折叠后可能不能完全展现抗原全貌，并且对最新出现的毒株仍然难以应对；不同的突变株进行S蛋白的结构域的嵌合重组和突变改造的重组蛋白疫苗，需进行重复的筛选与验证，保护性难以确定，且工序复杂，成本较高。
[0003]目前有多项研究表明，由不同突变株RBD或S蛋白组合的多价或多聚体疫苗对Omicron等变异株的保护效力明显提高。但在前期研究中我们发现基于包含大多数变异株突变位点Omicron RBD蛋白开发的疫苗免疫原性极低。厦门大学夏宁邵团队采用“谱系嵌合——突变补丁”的策略，即选择不同的突变株进行S蛋白的结构域的嵌合重组和突变改造，通过筛选最优组合实现了更广谱的抗原覆盖。基于以上研究及发现，我们猜想直接采用突变改造的方法在原始RBD序列上引入不同毒株的特征性突变位点是否能够实现广谱的抗原覆盖，基于此我们设计了多条全新改造的RBD序列，采用原核方式进行表达纯化后免疫Balb/c小鼠并采用真及假病毒中和实验检测该RBD疫苗免疫小鼠后产生中和抗体水平，以期解决现有疫苗广谱性不足，提高疫苗的广谱性，使其能应对未来最新出现的变异株的免疫逃逸的问题。

技术实现思路

[0004]本发专利技术的主要目的是提供一种新冠病毒突变体通用型疫苗cRBD以期解决现有疫苗广谱性不足，提高疫苗的广谱性，使其能应对未来最新出现的变异株的免疫逃逸的问题。
[0005]为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：作为一种实施方式，如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列在制备新型冠状病毒突变体通用型疫苗中的应用。
[0006]进一步的，本专利技术提供了如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，所述氨基酸序列由如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列转录、翻译获得。
[0007]如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在制备新型冠状病毒突变体通用型疫苗中的应用。
[0008]进一步的，本专利技术提供一种重组载体，包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。优选的，载体骨架为pET
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28a(+)。
[0009]进一步的，本专利技术提供的重组载体可应用在制备新型冠状病毒突变体通用型疫苗。
[0010]优选的，所述新型冠状病毒突变体为：Alpha或 Beta或 Delta或Omicron。
[0011]进一步的，本专利技术提供一种具体的应用，包括以下步骤：S1：将如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连接至pET
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28a(+)，构建pET
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28a(+)
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cRBD1重组载体后，转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达；S2：对含重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和培养后，离心收集菌体，采用裂解液重悬菌体，使菌体裂解，收集沉淀；S3：此时表达的cRBD蛋白均在包涵体沉淀中，随后从包涵体中提取纯化该cRBD蛋白；S4：将纯化后的cRBD蛋白按体积比1:1比例与AddaS03水包油型纳米乳液佐剂混合后即获得新冠病毒突变体通用型疫苗。
[0012]进一步的，步骤S2中，所述裂解液由碧云天细菌活性蛋白抽提试剂，添加1%蛋白酶抑制剂，10mM EDTA, 0.1mg/ml溶菌酶及10U/ml超级核酸酶构成。
[0013]进一步的，步骤S3中，从包涵体中提取纯化该cRBD蛋白的步骤为：S3
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1：洗涤缓冲液洗涤包涵体，所述洗涤缓冲液由20mM Tris
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HCl，0.5M NaCl，2M尿素，1%Triton
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X100，pH=8.0构成, 将沉淀重悬于包涵体洗涤液中超声重悬，8000rp，20min离心收集沉淀，重复该步骤一次；S3
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2：随后溶解包涵体，将洗涤后的包涵体溶解于变性缓冲液中，所述变性缓冲液由20mM Tris
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HCl，0.5M NaCl，8M尿素，20mMβ
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巯基乙醇，pH=8.0构成, 超声使包涵体完全重悬，4℃搅拌溶解过夜；S3
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3： 收集溶解变性的蛋白溶液，4℃条件下8000rpm离心变性蛋白液30min，保留上清液,0.22μm滤膜过滤，BCA法测定蛋白浓度（康为世纪）；回收包涵体蛋白后需复性包涵体蛋白，将溶解的包涵体的上清缓慢滴加至包涵体复性缓冲液中使得稀释后浓度约为0.1mg/ml，所述复性缓冲液由20mM Tris
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HCl，0.5M NaCl， 2M尿素，20%甘油，2mMGSH，0.2mM GSSG，pH=8.0构成；S3
‑
4：4℃静置复性24h；复性后纯化cRBD蛋白，在得到的复性溶液中加入终浓度约为20mM的咪唑，0.22um滤膜过滤;;S3
‑
5：使用Akta蛋白纯化仪进行蛋白纯化；装柱后使用20mM咪唑，20mM Tris
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HCl，0.5M NaCl，pH=8.0缓冲液平衡柱子至280nm紫外吸收与基线持平，1.5ml/min上样后使用500mM咪唑，20mM Tris
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HCl，0.5M NaCl缓冲液洗脱蛋白，收集280nm紫外吸收峰值附近的流出得到纯化后的RBD蛋白；S3
‑
5：使用Hi Prep 26/10脱盐柱对蛋白溶液进行脱盐并置换到PBS缓冲液中。
[0014]本专利技术采用突变改造的方法在原始RBD序列上引入不同毒株的特征性突变位点和免疫逃逸关键位点实现广谱的抗原覆盖，具体的设计了1条全新改造的RBD序列cRBD
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1，如
SEQIDNO：2所示，其编码氨基酸如SEQIDNO：1所示，采用原核方式进行表达纯化后免疫Balb/c小鼠并采用真及假病毒中和实验检测该RBD疫苗免疫小鼠后产生中和抗体水平。
[0015]本专利技术中发现，小鼠在经过三次免疫后对不同突变株（Alpha,Beta,Delta,Om本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列在制备新型冠状病毒突变体通用型疫苗中的应用。2.如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列由如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列转录、翻译获得。3.如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在制备新型冠状病毒突变体通用型疫苗中的应用。4.一种重组载体，其特征在于，包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，载体骨架为pET
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28a(+)。6.根据权利要求4所述的重组载体在制备新型冠状病毒突变体通用型疫苗中的应用。7.根据权利要求1或3或6所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒突变体为：Alpha或Beta或Delta或Omicron。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1：将如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连接至pET
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28a(+)，构建pET
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28a(+)
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cRBD1重组载体后，转入大肠杆菌BL21中进行表达；S2：对含重组载体的大肠杆菌BL21进行诱导表达和培养后，离心收集菌体，采用裂解液重悬菌体，使菌体裂解，收集沉淀；S3：此时表达的cRBD蛋白均在包涵体沉淀中，随后从包涵体中提取纯化该cRBD蛋白；S4：将纯化后的cRBD蛋白按体积比1:1比例与AddaS03水包油型纳米乳液佐剂混合后即获得新冠病毒突变体通用型疫苗。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤S2中，所述裂解液由碧云天细菌活性蛋白抽提试剂，添加1%蛋白酶抑制剂，10mM EDTA, 0.1mg/ml溶菌酶及10U/ml超级核酸酶构成。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤S3中，从包涵体中提取纯化该cRBD蛋白的步骤为：S3
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1：洗涤缓冲液洗涤包涵体，所述洗涤缓冲液由20mM Tris
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【专利技术属性】
技术研发人员：鲁帅尧，杨浩，安然，王俊斌，周亚楠，唐聪，杨云，黄青，禹文海，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：