一种食细菌类Panagrolaimus线虫人工培养和繁殖方法技术

本发明专利技术属于线虫人工培育领域，具体涉及一种食细菌类Panagrolaimus线虫人工培养和繁殖方法。首先，本发明专利技术提供了一种食细菌类Panagrolaimus线虫的培养基，所述培养基包括氯化钠、胰蛋白胨、琼脂和蒸馏水，每升蒸馏水中含有氯化钠3g、胰蛋白胨2g、琼脂24g；其次，本发明专利技术提供了一种食细菌类Panagrolaimus线虫的人工培养方法，本发明专利技术意外发现在21℃培养温度条件下，配合本申请所述的培养基，能够显著促进线虫的生长繁殖；所述培养基使用前不需要调pH，可直接使用，且能明显抑制线虫钻孔情况，保证培养基的完整性，可减少更换培养基次数，节约培养成本，具有广阔的前景。具有广阔的前景。具有广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】
一种食细菌类Panagrolaimus线虫人工培养和繁殖方法


[0001]本专利技术属于线虫人工培育领域，具体涉及一种食细菌类Panagrolaimus线虫人工培养和繁殖方法。

技术介绍

[0002]线虫是土壤中最为丰富的无脊椎动物，其分布广泛、数量巨大，能够占据土壤食物网的所有营养级，在生物地球化学循环中扮演着重要角色。相关研究表明，土壤线虫不仅有助于解释土壤生态系统结构，还因其形态特殊性及可对各种变化环境做出较迅速的反应等特点，被认作为是土壤中主要指示生物，用来表征土壤生态系统的健康安全状况。
[0003]食细菌类Panagrolaimus线虫具有数量丰富、分布范围广、繁殖速度快等特点，是具有重要生态功能的土壤线虫。根据野外实验调查发现，Panagrolaimus线虫可以在极端环境中生存，对土壤有机物、重金属等环境污染具有很好的指示作用，采用室内培养该种线虫可用于气候与环境变化导致的土壤生态系统变化的生物监测。食细菌类Panagrolaimus线虫是具有三种不同的生殖模式(雌雄异体、雌雄同体和单性生殖)的线虫属(Molecular evolution in Panagrolaimus nematodes:origins of parthenogenesis,hermaphroditism and the Antarctic species P.davidi.BMC Evolutionary Biology,2009,1471
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2148)。在不同的土壤生态系统中，Panagrolaimus线虫是线虫群落的主要组成部分，其成虫虫体长在0.4
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0.8mm左右。当前，关于线虫的培养方法大致分为两种，分别是液体培养基(“S”培养基)培养和固体培养基(NGM培养基)培养。
[0004]现有研究中，关于Panagrolaimus线虫的培养大多是采用加入Escherichia coli OP50品系的“S”液体培养基中进行培养，但使用液体培养基中线虫条数及繁殖不易被观察且Escherichia coli OP50在液体培养基中极易受染杂菌，导致实验过程繁琐，培养成本较高；而以目前常用的秀丽隐杆线虫的线虫培养基(NGM培养基)进行食细菌类Panagrolaimus线虫培养时，培养基含水量较高，在培养过程中除去易出现培养基易被污染的现象，需要每一个繁殖周期都要更换一次培养基外，在富集培养过程中还会出现线虫钻入培养基内的现象，进而导致线虫大量死亡，繁殖率极低，延长富集周期；而且目前公知的室内培养野外野生线虫的最佳培养温度为25
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28℃，但是本专利技术发现在25
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28℃条件下培养食细菌类Panagrolaimus线虫时，繁殖率很低，富集时间较长。

技术实现思路

[0005]针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种食细菌类Panagrolaimus线虫人工培养和繁殖方法，具体包括以下内容：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种食细菌类Panagrolaimus线虫培养基，所述培养基包括氯化钠、胰蛋白胨、琼脂和蒸馏水；所述氯化钠、胰蛋白胨、琼脂和蒸馏水的比例为3g:2g:24g:1L。
[0007]优选地，所述培养基还包括磷酸钾缓冲液、氯化钙、硫酸镁和胆固醇溶液。
[0008]优选地，每500mL培养基中含有1M磷酸钾缓冲液12.5mL，1M氯化钙0.5mL，1M硫酸镁0.5mL，5mg/mL胆固醇溶液0.5mL。
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种食细菌类Panagrolaimus线虫培养基的制备方法，所述方法为：将氯化钠、胰蛋白胨、琼脂加入蒸馏水中，灭菌后分别加入灭菌的磷酸钾缓冲液、氯化钙、硫酸镁和胆固醇溶液，混匀即得食细菌类Panagrolaimus线虫培养基。
[0010]优选地，所述灭菌方法为121℃灭菌20min后，紫外灭菌10min。
[0011]优选地，所述121℃灭菌20min后，置于恒温70℃的恒温培养箱进行降温1.5～2h，待温度稳定后再进行紫外灭菌10min。
[0012]第三方面，本专利技术提供了一种食细菌类Panagrolaimus线虫的培养方法，所述方法包括以下步骤：
[0013](1)制备大肠杆菌菌悬液；
[0014](2)制备线虫培养平板：根据上述第二方面所述方法制备食细菌类Panagrolaimus线虫培养基，紫外线照射处理后吹干，将大肠杆菌菌悬液涂抹在培养基表面，获得线虫培养平板；
[0015](3)Panagrolaimus线虫培养：将线虫用无菌水洗涤，将沉淀的线虫置于线虫培养平板上，21℃培养。
[0016]优选地，所述步骤(1)中大肠杆菌菌悬液的制备方法为：取E.coli OP50菌株接入50mL液体LB培养基中，37℃摇床培养36h得细菌菌液，菌液离心，去除1/2上清液后获得大肠杆菌菌悬液。
[0017]优选地，所述步骤(2)中紫外线照射处理后吹干步骤为：将食细菌类Panagrolaimus线虫培养基用紫外线照射20min后，风干1.5～2.5h，再用紫外线照射20min后，收起倒置一夜。
[0018]优选地，所述步骤(3)中培养湿度为40～50％。
[0019]本专利技术的有益效果是：本专利技术首先提供了一种食细菌类Panagrolaimus线虫培养基，所述培养基在使用前不需要调pH，可直接使用，且能明显抑制线虫钻孔情况，保证培养板的完整性，可实现重复利用；所述培养基可以缩短培养基风干时间，在一定程度内避免了培养基意外污染，有效减轻线虫钻培养基现象，更有利于获得线虫；其次，本专利技术提供了一种食细菌类Panagrolaimus线虫的培养方法，本专利技术意外发现在21℃条件下采用本专利技术所述的培养基培养食细菌类Panagrolaimus线虫，能够显著提高食细菌类Panagrolaimus线虫的繁殖力，实现食细菌类Panagrolaimus线虫的可控可持续培养；而且操作简单，容易实施，具有广阔的前景。
附图说明
[0020]图1线虫培养平板1中线虫繁殖状况；
[0021]图2线虫培养平板2中线虫繁殖状况；
[0022]图3线虫培养平板3中线虫繁殖状况。
具体实施方式
[0023]以下通过优选的实施案例的形式对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明，但其
不会构成对本专利技术的限制。
[0024]以下实施例所述氯化钠为上海国药集团分析纯NaCl；所述酵母膏购自于OXOID生物公司；所述胰蛋白胨购自于OXOID生物公司；所述琼脂粉购自于Solarbio公司；所述摇床为具有恒温控温功能的实验室使用的摇床，如欧莱博恒温摇床OLB
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100C；所述培养箱为具有恒温恒湿功能的培养箱，如宁波江南恒温恒湿培养箱HWS
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380；所用的微量移液器范围为10～1000uL。
[0025]以下实施例中所述2mol/L NaOH的制备：称取8g NaOH溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食细菌类Panagrolaimus线虫培养基，其特征在于，所述培养基包括氯化钠、胰蛋白胨、琼脂和蒸馏水；所述氯化钠、胰蛋白胨、琼脂和蒸馏水的比例为3g:2g:24g:1L。2.如权利要求1所述的食细菌类Panagrolaimus线虫培养基，其特征在于，所述培养基还包括磷酸钾缓冲液、氯化钙、硫酸镁和胆固醇溶液。3.如权利要求2所述的食细菌类Panagrolaimus线虫培养基，其特征在于，每500mL培养基中含有1M磷酸钾缓冲液12.5mL，1M氯化钙0.5mL，1M硫酸镁0.5mL，5mg/mL胆固醇溶液0.5mL。4.如权利要求3所述的食细菌类Panagrolaimus线虫培养基的制备方法，其特征在于，所述方法为：将氯化钠、胰蛋白胨、琼脂加入蒸馏水中，灭菌后分别加入灭菌的磷酸钾缓冲液、氯化钙、硫酸镁和胆固醇溶液，混匀即得食细菌类Panagrolaimus线虫培养基。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述灭菌方法为121℃灭菌20min后，紫外灭菌10min。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述121℃灭菌20min后，置于恒温70℃的恒温培养箱进行降温1.5～2h，待温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈书燕，刘旭，金梦焕，蒋潇玉，肖洒，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：