一种提高PD-L1检测灵敏度的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种提高PD

【技术实现步骤摘要】
一种提高PD
‑
L1检测灵敏度的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及医学检测诊断
，具体涉及一种提高PD
‑
L1检测灵敏度的方法及其应用。

技术介绍

[0002]程序性细胞死亡蛋白1(PD
‑
1)主要在活化的T细胞上表达，是一种重要的免疫检查点受体。免疫球蛋白样免疫抑制分子，如程序性死亡配体(PD
‑
L1)在多种细胞类型上表达，包括肿瘤细胞、巨噬细胞、树突状细胞和基质细胞。活化T细胞上的PD
‑
1在与肿瘤细胞和肿瘤微环境中的PD
‑
1配体(PD
‑
L1或PD
‑
L2)结合后，向T细胞传递抑制性信号，会抑制CD8 T细胞增殖、细胞因子释放和细胞溶解活性，导致癌细胞逃避免疫监视。肿瘤细胞上的PD
‑
L1与PD
‑
1相互作用，使肿瘤细胞能够逃脱T细胞介导的免疫监视。免疫检查点抑制剂(ICI)，包括PD
‑
1/PD
‑
L1抑制剂等，能够阻断免疫检查点之间的相互作用。因此，通过单克隆抗体阻断PD
‑
L1和PD
‑
1相互作用可重新激活肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，有助于通过减少免疫逃逸机制来治疗肿瘤。在针对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的研究中，外周血中PD
‑
1水平(表达百分比)升高与预后较差有关；PD
‑
1TILs的量与肿瘤细胞和/或巨噬细胞中PD
‑
L1表达呈正相关。DLBCL中，阻断PD
‑
L1会导致T细胞的IFNγ分泌增强；在体外用抗PD
‑
L1抗体或PD
‑
1融合蛋白阻断PD
‑
L1，能恢复非霍奇金淋巴瘤的肿瘤部位部分的T细胞增殖。DLBCL患者在接受PD
‑
1/PD
‑
L1抑制剂和R
‑
CHOP、Dinaciclib、CAR T细胞等其它治疗途径的联合治疗时，病人缓解率可得到明显的提高。尽管PD
‑
1/PD
‑
L1抑制剂在DLBCL患者治疗中展示了其有效性，但是，对DLBCL治疗的报道仍然较少，可能源于对PD
‑
1/PD
‑
L1抑制剂临床应用的标准不够精准。因此，仍需要探究能否出现更好的检测指标，更加灵敏、精准的指导PD
‑
1/PD
‑
L1抑制剂在肿瘤病人的临床应用。
[0003]通过对肿瘤患者组织进行免疫组化分析PD
‑
L1表达，是指导免疫检查点抑制剂使用的重要标准。然而，现有证据表明，PD
‑
L1水平的评估与抗PD
‑
1/PD
‑
L1治疗存在反应不一致，难以成为很可靠的预测因子。而且，基于目前的PD
‑
L1检测方法，在一些研究中PD
‑
L1阳性和PD
‑
L1阴性患者均能从免疫治疗中获益，这说明了目前的PD
‑
L1检测方法的检测准确性或有效性存在一定的误差。而且，在对临床样本进行免疫组化检测时，对PD
‑
L1抗体的选择，不同的实验室也不尽相同，检测灵敏度也存在较大的差异。因此，开发一种能够提高PD
‑
L1检测灵敏度的方法对于基于PD
‑
1/PD
‑
L1抑制剂相关的治疗及研究具有极为重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供一种提高PD
‑
L1检测灵敏度的方法及其应用。该方法通过对程序性死亡受体
‑
配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD
‑
L1)进行特异性的去糖基化处理，应用对应的特异性抗体(一抗)进行孵育后，显著增强了PD
‑
L1信号强度，以此提高了其在临床检测灵敏度和特异性，为免疫检查点PD
‑
L1的检测以及指导PD
‑
1/PD
‑
L1抑制剂的临床治疗提供了有利
的技术支持。
[0005]本专利技术的第一个方面，提供一种提高PD
‑
L1检测灵敏度的方法，所述方法包括：
[0006]采用免疫组化方法进行PD
‑
L1检测，在抗原修复步骤后进行糖蛋白变性，然后进行去糖基化处理，终止去糖基化反应，封闭液封闭后，加入与糖基化位点对应的PD
‑
L1一抗，继续后续检测步骤。
[0007]在本专利技术的一些实施方式中，所述去糖基化处理为：使用去糖基化酶或糖苷酶孵育12
‑
16h。
[0008]在本专利技术的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶的孵育温度为35～38℃。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，本领域技术人员可以根据实际条件情况，合理调整孵育温度并对应调整孵育时间，以获得本专利技术中所能要求实现的去糖基化效果。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶包括Endo H酶和PNGase F酶。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的去糖基化酶或糖苷酶，包括但不限于Endo H酶和PNGase F酶。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶的使用浓度为3％～5％(v/v)。
[0012]在本专利技术中，专利技术人优选了去糖基化最适酶反应条件，评估了PD
‑
L1免疫组化检测最敏感抗体，有效提高了PD
‑
L1检测灵敏度和特异性，使本专利技术中的方法具有高灵敏度、强特异性、背景清晰、操作方便，适用于石蜡切片及固定的细胞涂片，可用于检测细胞、组织内的特异性抗原等优势。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述终止去糖基化反应包括：用TBST洗涤。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，在终止去糖基化反应后使用过氧化氢进行灭活处理。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的试剂或方式进行灭活处理，包括但不限于使用过氧化氢或醋酸。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述灭活处理针对组织样本中的过氧化物酶。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述过氧化氢为过氧化氢溶液，其使用过氧化氢与甲醇配制得到。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述过氧化氢溶液为甲醇稀释的3％H2O2。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述灭活处理的处理时间为8～12min。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述灭活处理的处理时间为10min。
[0020]在本专利技术的一些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高PD
‑
L1检测灵敏度的方法，其特征在于，所述方法包括：采用免疫组化方法进行PD
‑
L1检测，在抗原修复步骤后进行糖蛋白变性，然后进行去糖基化处理，终止去糖基化反应，封闭液封闭后，加入与糖基化位点对应的PD
‑
L1一抗，继续后续检测步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去糖基化处理为：使用去糖基化酶或糖苷酶孵育12
‑
16h。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述去糖基化酶或糖苷酶包括Endo H酶和PNGase F酶。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述终止去糖基化反应包括：用TBST洗涤。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭活处理的处理时间为8～12min。6.去糖基化酶或糖苷酶在制备PD
‑
L1检测产品中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭锋杰，符馨月，谢克平，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：