本发明专利技术公开了一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5及其制备方法和用途，该抗菌肽SpCru5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过宏基因组学技术获得一株比目鱼肠道的基因组，并通过保守序列分析得到抗菌肽SpCru5及其核苷酸序列，通过基因工程技术首次实现该抗菌肽SpCru5在毕赤酵母X33中的表达，重组表达的抗菌肽SpCru5依然保持抗菌活性，并且抗菌谱广，对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。
【技术实现步骤摘要】
一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5及其制备方法和用途
[0001]本专利技术涉及一种抗菌肽，具体涉及一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5及其制备方法和用途。
技术介绍
[0002]抗菌肽(AMPs)是一类小分子多肽(含10～60个氨基酸)，其富含正电荷和疏水性氨基酸，一般只具有二级结构。抗菌肽几乎以各种形式存在于所有的生物体中，是组成生物先天免疫的重要部分，因此又被称为抗微生物肽或宿主防御肽。
[0003]抗菌肽具有广谱的抗菌活性，主要体现在抗细菌、抗真菌和抗病毒等微生物；抗菌肽还有抗炎、免疫调节活性以及对癌细胞的毒性等生物学活性。抗菌肽由于其独特的破膜杀菌机制，使其不易产生耐药性，加之其无免疫原性和对真核细胞较低的毒性，使得抗菌肽有望成为抗生素的替代品，以解决耐药性等问题。
[0004]目前获取抗菌肽的方法有生物提取、化学合成和异源表达，然而，抗菌肽的天然提取产量低，采用化学合成成本昂贵，通过基因工程技术大量表达是开发、生产抗菌肽的有效方法，且近些年分子生物学和DNA重组技术的发展也为抗菌肽的基因工程化提供了良好的技术支持。
[0005]相对于原核表达系统来说，作为真核表达系统的毕赤酵母表达系统具有更多优势：毕赤酵母发酵营养要求低、成本低、能够高密度发酵且产量高，生产工艺简化，可以确保重组的抗菌肽活性较接近于天然状态，大大提高了抗菌肽的产量和商业的规模化生产，为寻找和开发抗生素的有效替代品提供了新的研究策略。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是提供一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5及其制备方法和用途，该重组表达的抗菌肽SpCru5依然保持抗菌活性，并且抗菌谱广，对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5，该抗菌肽SpCru5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的另一目的是提供所述的抗菌肽SpCru5的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术的另一目的是提供用于扩增所述的编码基因的引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0010]本专利技术的另一目的是提供含有所述的编码基因的重组载体。
[0011]优选地，载体选用pPIC9K。
[0012]本专利技术的另一目的是提供含有所述的重组载体的重组菌。
[0013]优选地，菌选用毕赤酵母。
[0014]本专利技术的另一目的是提供所述的抗菌肽SpCru5的制备方法，该方法包含：
[0015](1)以比目鱼肠道基因组DNA为模板，采用如权利要求3所述的引物对进行PCR扩增，获得抗菌肽SpCru5的编码基因；
[0016](2)表达载体pPIC9K用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，再用C112重组连接酶连接后转化至感受态细胞中，测序验证正确后，得到重组表达质粒pPIC9K
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SpCru5；
[0017](3)将测序正确的重组表达质粒pPIC9K
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SpCru5用限制性核酸内切酶Sal I进行线性化处理，电转化至毕赤酵母X33中用G418抗生素进行筛选，获得毕赤酵母表达抗菌肽SpCru5重组菌株；
[0018](4)通过甲醇诱导表达，获得高表达稳定性的抗菌肽SpCru5。
[0019]本专利技术的另一目的是提供所述的抗菌肽SpCru5在抑菌方面的用途，该抗菌肽SpCru5对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌和白色念珠菌中任意一种或两种以上的菌均具有抑制作用。
[0020]本专利技术的另一目的是提供所述的抗菌肽SpCru5在作为制备抗细菌感染治疗药物或畜牧业生产中的抑菌添加剂方面的用途。具体地，该抗菌肽SpCru5对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌和白色念珠菌中任意一种或两种以上的菌均具有抑制作用。
[0021]本专利技术的来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5及其制备方法和用途，具有以下优点：
[0022]本专利技术通过宏基因组学技术获得一株比目鱼肠道的基因组，并通过保守序列分析得到抗菌肽SpCru5及其核苷酸序列，通过基因工程技术首次实现该抗菌肽SpCru5在毕赤酵母X33中的表达，重组表达的抗菌肽SpCru5依然保持抗菌活性，并且抗菌谱广，对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。
[0023]本专利技术的抗菌肽SpCru5对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌均有不同的抑菌活性，其中对产气荚膜梭菌的抑菌圈均达到20mm以上。
附图说明
[0024]图1为本专利技术抗菌肽SpCru5编码基因的PCR扩增验证电泳图；
[0025]图2为本专利技术表达载体pPIC9K双酶切电泳图；
[0026]图3为本专利技术重组载体pPIC9K
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SpCru5阳性克隆验证电泳图；
[0027]图4为本专利技术重组表达抗菌肽SpCru5对大肠杆菌K88抑菌圈图；
[0028]图5为本专利技术重组表达抗菌肽SpCru5对金黄色葡萄球菌抑菌圈图；
[0029]图6为本专利技术重组表达抗菌肽SpCru5对铜绿假单胞菌抑菌圈图；
[0030]图7为本专利技术重组表达抗菌肽SpCru5对产气荚膜梭菌抑菌圈图；
[0031]图8为本专利技术重组表达抗菌肽SpCru5对白色念珠菌抑菌圈图；
[0032]图9为本专利技术抗生素卡那霉素不同浓度对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌抑菌圈图；
[0033]图10为本专利技术抗生素氨苄青霉素不同浓度对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌抑菌圈图。
具体实施方式
[0034]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0035]实验例1来源于比目鱼肠道宏基因组的抗菌肽SpCru5基因的获得
[0036]1、比目鱼肠道微生物宏基因组DNA的提取
[0037]抗菌肽SpCru5编码基因来源于本实验室保存的比目鱼肠道微生物宏基因组，利用SDS
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溶菌酶法提取其宏基因组DNA，其宏基因组DNA的提取步骤具体如下：
[0038](1)取比目鱼适量的小肠和胃内容物样品置于1.5mL离心管中，加入1mL无菌水吹打均匀，12000rpm离心5min，弃上清液；
[0039](2)加入300μL裂解液(购买自：赛默飞世尔科技公司，RIPA裂解和提取缓冲液，货号：89900)、0.5M EDTA 50mL、5MNaCl 5mL、20％SDS(十二烷基硫酸钠)25mL加入20mL无菌水，重悬；
[0040](3)加入33μL溶菌酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5，其特征在于，该抗菌肽SpCru5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的抗菌肽SpCru5的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.用于扩增如权利要求2所述的编码基因的引物对，其特征在于，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4.含有如权利要求2所述的编码基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，载体选用pPIC9K。6.含有如权利要求4或5所述的重组载体的重组菌。7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，菌选用毕赤酵母。8.如权利要求1所述的抗菌肽SpCru5的制备方法，其特征在于，该方法包含：(1)以比目鱼肠道基因组DNA为模板，采用如权利要求3所述的引物对进行PCR扩增，获得抗菌肽SpCru5的编码基因；(2)表达载体p...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵锡，宋婧楠，苗华彪，赵香帅，王璐，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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